biotechnologies, diversité génétique, biodiversité et environnement

Marqueurs SSR (microsatellites) et détection d'hybrides somatiques formés entre ls mandarinier et le citrange Carrizo. Examen du module S6

Les marqueurs basés sur la PCR comme SSR (microsatellites) sont souvent utilisés dans l'dentification précoce des ressources génétique et l'amélioration des plantes.


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Contrôle de la matière Marqueurs moléculaires et Amélioration des plantes du module 'Biotechnologies et Amélioration des plantes du Parcours S6 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Juin 2015", Durée : 75 minutes .......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve
Le Citrange Carrizo (Citrus sinensis L. x Poncirus trifoliata L.) est un hybride obtenu à Carrizo au Texas (USA) possédant plusieurs traits agronomiques dont la résistance à la Tristeza (maladie virale) et aux nématodes et une productivité élevée. Cependant, il ne tolère pas les régions très arides, calcaire et très salines. Le mandarinier est une rutacée qui supporte les sols acides et alcalins. Dans les zones trop froides, on le greffe sur un Poncirus afin qu'il puisse supporter les hivers plus rudes.
Olivares-Fuster et al. (2002, Annals of Botany 89, 491-497) ont étudié l'hybridation somatique entre le mandarinier (Espèce Citrus reticulata) et le citrange Carrizo. La régénération de plantes à partir d'embryons somatiques des hybrides résultant de la fusion (Figure 1), a permis l'exécution de tests de confirmation par les marqueurs moléculaires de type SSR
Protoplastes Mandarinier-Citrange

Des extraits d'ADN ont été préparés à partir des plantes d'origine ('parents') et des plantes hybrides somatiques. Après amplification sur la base du microsatellite TAA15, l'électrophorèse sur gel d'agarose 3%, suivie d'une révélation avec le bromure d'éthidium, a permis d'obtenir l'électrophoregramme représenté par la figure 2.

Protoplastes Mandarinier.  SSR (microsatellites)
.

1) Quelles peuvent être les raisons possibles de recours à l'hybridation somatique pour l'amélioration génétique du mandarinier (Citrus reticulata L.) ?
2) Rappeler brièvement la technique de fusion des protoplastes dans la création variétale.
3) Quel(s) critère(s) moléculaire(s) exploite la technique d'électrophorèse de l'ADN. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal. Justifier votre réponse.
4) Sur quel principe se base la révélation de l'ADN par le bromure d'éthidium ?
5) Rappeler les étapes principales de la PCR et de l'électrophorèse permettant la mise en évidence d'un polymorphisme détecté par les marqueurs de type SSR.
6) Pour quelles raisons les auteurs ont utilisé l'agarose 3% pour séparer par électrophorèse les fragments d'ADN résultant de l'amplification par PCR ?. Y'a-t-il une autre alternative ?
7) Quels sont les nombres d'allèles SSR montrés par le mandarinier (M), le Citrange Carrizo (C) et les deux plantes régénérées à partir des hybrides somatiques (M+C).
8) Quelle(s) différence(s) structurale(s) existe(ent)-t-elle(s) entre les fragments d'ADN de petite taille et celles de grande taille ?
9) Quelles sont les conclusions à tirer quant à l'efficacité d'utilisation du marquage de type 'SSR' dans ce genre d'étude?. Serait-il possible de trouver les mêmes résultats avec les marqueurs AFLP ?. Justifier votre réponse.


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Corrections brèves --- Revenir aux questions

Réponse à la Question 1: raisons possibles de recours à l'hybridation somatique pour l'amélioration génétique du mandarinier (Citrus reticulata L.)

- Rétrécissement de la diversité génétique intraspécifique chez le mandarinier et/ou che le citrange Carrizo.
- Présence possible d'interstérilité entre le mandarinier et le citrange Carrizo.
- Objectif: Obtenir un hybride qui associerait la résistance à la Tristeza (maladie virale) et aux nématodes et la productivité élevée, traits portés par Le citrange Carrizo (Citrus sinensis L. x Poncirus trifoliata L.) et l'adaptation aux sols très acides et basiques (traits portés par le mandarinier).

Réponse à la Question 2: technique de fusion des protoplastes dans la création variétale.

Dans le but d'une fusion, les protoplastes sont préparés par destruction de la paroi cellulaire par digestion enzymatique, grâce à des enzymes telles que la pectinase, la cellulase ou le lysozyme. On obtient des cellules sphériques qui sont fusionnées par PEG ou par application d'un courant électrique dans le but d'obtenir des hybrides somatiques.

Réponse à la Question 3: critère(s) moléculaire(s) exploite la technique d'électrophorèse de l'ADN. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal.

L'éléctrophorèse de l'ADN sur gel d'agarose ou de polyacrylamide, exploite les critères de la taille et de l'ionicité (charge électrique). Comme les acides nucléiques sont de nature chargés négativement (-) à cause du phosphore, les fragments de l'ADN sont séparés selon le critère de la taille, uniquement. L'orsqu'il s'agit des plasmides, la forme la forme de 'ADN intervient dans la séparation (ADN: forme superenroulée, forme relâchée et forme linéaire).

Réponse à la Question 4: principe se base la révélation de l'ADN par le bromure d'éthidium.

Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicarénaire par intercalation entre les bases.

Réponse à la Question 5: étapes principales de la PCR et de l'électrophorèse permettant la mise en évidence d'un polymorphisme détecté par les marqueurs de type SSR

Les microsatellites (SSR) sont constitués de séquences de di-, tri- ou tétra-nucléotides répétés en tandem. Le polymorphisme de type SSR repose sur la variation du nombre d'unités de répétition constituant le microsatellite. Le multiallélisme est la caractéristique principale des microsatellites. Lien: Marqueurs SSR (microsatellites).

- Amplification de l'ADN par la PCR en utilisant deux amorces (1 paire) de 20-40 nucléotides et la Taq DNA polymérase
- Electrophorèse, réalisée souvant sur gel de polyacrylamide, rarement sur des gels d'agarose à haute concentrations.
- R évélation des fragments d'ADN amplifiés par une méthode appropriée pouvant correspondre au bromure d'étidium ou le nitrate d'argent (pour gels de polyacrylamide).

Réponse à la Question 6: Raisons de l'utilisation de l'agarose 3% pour séparer par électrophorèse les fragments d'ADN résultant de l'amplification par PCR ?. Y'a-t-il une autre alternative ?.

Les auteurs ont opté pour l'agarose très concentrée (3%) pour séparer les microsatellites pour limiter d'éventuelles fuite hors gels des petis fragments d'ADN généralement formés avec la technique SSR. Les marqueurs de types SSR étant de petite taille nécessitent des gels de polyacrylamide ou des gels d'agarose plus concentrés pour réussir leur séparation. Les fragments d'ADN de séquences courtes, étant de migration rapide, peuvent sortir de façon précoce des gels moins concentrés. Les marqueurs de type RAPD, étant de taille moyenne, les gels d'agarose 0,8%-1,5% restent convenables pour leur séparation.

Réponse à la Question 7: nombres d'allèles SSR montrés par le mandarinier (M), le Citrange Carrizo (C) et les deux plantes régénérées à partir des hybrides somatiques (M+C).

M: 7, C; 5, les deux plants (M +C): 9

Réponse à la Question 8: différence(s) structurale(s) existe(ent)-t-elle(s) entre les fragments d'ADN de petite taille et celles de grande taille.

Les fragments d'ADN de petite taille résultant de l'amplification par PCR en présence des amorces SSR sont des répétitions d'un trinucléotide (ici TAA). Les frangments de petites tailles (migrant rapidement vers l'anode +) sont caractérisés par un nombre de répétition faible.

Réponse à la Question 9: conclusions à tirer quant à l'efficacité d'utilisation du marquage de type 'SSR' dans ce genre d'étude?. Serait-il possible de trouver les mêmes résultats avec les marqueurs AFLP ?.

L'éfficacité de l'identification des hybrides somatiques par les SSR revient à leur caractère de codominance. Les hybrides reflètent le contenu d'au moins un des deux parents utilisés dans la fusion des protoplastes. Ainsi:

- Fragment 500 pb, existant chez les hybrides (M+C), est présent chez le parent M et absent chez le parent C.

- Fragment 400 pb, existant chez les hybrides (M+C), est présent chez le parent C et absent chez le parent M.

- Le doublet de taille approximative 175 pb et 190 pb, existant chez les hybrides (M+C), est présent chez le parent M et absent chez le parent C.

- Le doublet de taille approximative 145 pb et 150 pb, existant chez les hybrides (M+C), est présent chez le parent C et absent chez le parent M.

Etant de caractère dominant, le marquage de type AFLP ne permet pas d'identifier facilement les hybrides somatiques entre le mandarinier et le citrange Carrizo



Marqueurs SSR (microsatellites), Examen