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RFLP et sélection d'hybrides somatiques de l'oranger obtenus par fusion des protoplaste . Examen du module S5

Etant de caractère codominant, les marqueurs moléculaires RFLP peuvent être utilisé dans la sélection d'hybrides somatiques provenant de la fusion des protoplastes.

Ici, le cas de l'oranger (Citrus sinensis) traité dans le cadre d'un examen de rattrapage S5 (Module 'Génétique et amélioration des Plantes'.


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Marqueurs moléculaires et Amélioration des Plantes, Eémént de Module 'Génétique et amélioration des plantes', MODULE 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes', Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Contrôle de rattrapage, Janvier 2012, Enseignant : M. Baaziz, durée : 45 minutes ........... Corrections brèves à la fin de l'épreuve

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QCM, Exercices, Examens en Sciences de la Vie-Biochimie dans le livre (+ CD), Arabe et Français:

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L'oranger (Citrus sinensis L.) est un arbre fruitier de la famille des Rutacées, plantes qui produisent les agrumes. L'oranger est un hybride ancien résultant probablement d'un croisement entre le pamplemousse (Citrus maxima) et la mandarine (Citrus reticulata). Décidant d'améliorer génétiquement cette espèce (appelée 'Trovita orange', Shinozaki et al. (1992, Japan J. Breed. 42, 227-95) ont réalisé la fusion des protoplastes de cet oranger avec ceux de l'espèce Murraya paniculata (orange sauvage ou 'oranger jasmin') qui s'adpte bien aux sols alcalins, en plus d'être résistante aux nématodes (voir figure ci-dessous). Les plantes régénérées à partir des protoplastes fusionnés ont été analysées pour le polymorphisme de restriction de leurs ADN par la technique 'RFLP'.

Oranger. Protoplastes

L'ADN a été hydrolysé séparément par deux enzymes de restriction (Afa1 et Xho1). L'hybridation a été réalisée par une sonde hétérologue (ADN de riz) marquée à la peroxydase. Les résultats obtenus sont résumés dans la figure ci-dessous.

Marqueurs RFLP (oranger)


1) Quelles peuvent être les raisons possibles de recours à d'autres espèces de rutacées (comme Murraya paniculata) pour l'amélioration génétique de l'oranger (Citrus sinensis) ?

2) Rappeler brièvement la technique de fusion des protoplastes dans la création variétale.

3) Quel(s) critère(s) moléculaire(s) exploite la technique d'électrophorèse de l'ADN. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal. Justifier votre réponse

4) Rappeler les étapes principales de la technique 'RFLP'.

5) Interpréter les électrophorégrammes correspondant à la digestion par les enzymes de restriction Afa1 et Xho1 des ADN provenant de 'orange jessamine' (Murraya paniculata, O), 'orange Trotiva' (Citrus sinensis, T) et de l'hybride résultant de la fusion des protoplastes (TO). Quelles sont les conclusions à tirer quant à l'efficacité d'utilisation du marquage de type 'RFLP' dans ce genre d'étude?. Justifier votre réponse.



Corrections brèves

Réponse à la Question 1: Les raisons possibles à l'origine du recours à d'autres espèces de rutacées (comme Murraya paniculata, oranger sauvage) pour l'amélioration génétique de l'oranger (Citrus sinensis) résident essentiellement dans le rétrécissement de la diversité génétique de l'oranger (Citrus sinensis). Le recours à d'autres espèces proches devient nécessaire.

Lien utile : http://www.biotech-ecolo.net/amelioration-genetique-plantes.html

Réponse à la Question 2: La préparation des protoplastes dans le but de réaliser leur fusion, consiste à détruire la paroi cellulaire par digestion enzymatique, grâce à des enzymes telles que la pectinase, la cellulase ou le lysozyme. On obtient ainsi des cellules sphériques. Ensuite, les cellules sont fusionnées par PEG ou par application d'un courant électrique dans le but d'obtenir des hybrides somatiques.

Réponse à la Question 3: L'éléctrophorèse de l'ADN exploite les critères de la taille et de l'ionicité (charge électrique). Cependant, la même charge (-) des fragments de l'ADN (dues au phosphore) entraîne une séparation sur le critère de la taille, uniquement. La forme des fragments d'ADN résultant de la digestion de l'ADN n'intervient pas dans la séparation.

Lien utile : http://www.takween.com/techniques/techniques-biochimie.html

Réponse à la Question 4: Les étapes principales de la technique RFLP sont :

- Purification suffisante de l'ADN
- Digestion de l'ADN par une enzyme de restriction
- Electrophorèse des fragments d'ADN sur gel
- Transfert des fragments d'ADN séparés sur membrane de nitrocellulose
- Hybridation des fragments par une sonde (homologue ou hétérologue) marquée par une enzyme (comme la peroxydase) ou par radioactivité

Lien utile : http://www.takween.com/techniques/10_RFLP.pdf

Réponse à la Question 5: Interprétation des électrophorégrammes obtenus avec les deux enzymes de restriction :

- Enzyme de restriction Afa1 :

On constate que l'hybride somatique hérite de l'oranger sauvage (Murraya paniculata) et de l'ornager cultivé plusieur séquences nucléotidiques (représentées par des bandes), dont :
- Bande de Rf d'environ 0.25 qui provient de Murraya paniculata, mais n'existant pas chez l'oranger cultivé (Citrus sinensis)
- Bande de Rf égal à 0,35, environ existant uniquement chez l'oranger cultivé

- Enzyme de restriction Xho1 :

Avec l'enzyme de restriction Xho1, on découvre que l'ADN de l'hybride somatique contient des séquences nucléotidiques provenant des deux espèces d'oranger. On peut en citer le fragment d'ADN correspondant à la bande de approximatif 0,60 (taille proche de 4,4 kbp) hérité de l'oranger sauvage, mais n'existant pas chez l'oranger cultivé.

Les fragments d'ADN caractéristiques des deux espèces d'oranger sont apparents chez l'hybride somatique. Ceci témoigne de la codominance du marquage de type RFLP. Le caractère codominant des marqueurs RFLP fait d'eux des outils moléculaires puissants dans l'identification des hybrides.


Liens utiles:

Isoenzymes-mutations : http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-mutations.pdf
Isozymes. Principe de détection : http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-detection.pdf
Isozymes : loci, allèles : http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-loci-alleles.pdf
RFLP : http://www.takween.com/techniques/10_RFLP.pdf
RAPD : http://www.takween.com/techniques/11_RAPD.pdf
AFLP : http://www.takween.com/techniques/13_AFLP.pdf
SSR (microsatellites) : http://www.takween.com/techniques/microsatellites-SSR-marqueurs.pdf


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