Le développement de la technique PCR offre l'avantage d'analyser les marqueurs moléculaires en un temps court tout en utilisant des concentrations faibles d'ADN. Les marqueurs basés sur la technique PCR tendent à remplacer les systèmes classiques (les marqueurs morphologiques, isoenzymatiques et RFLP) et deviennent très nombreux et diversifiés.
Marqueurs moléculaires basés sur la PCR
Contrairement aux marqueurs moléculaires de type 'RFLP' résultant de la restriction de l'ADN, les marqueurs moléculaires basés sur la PCR concernent les sites de fixation d'amorces ADN. La technique PCR consiste à dénaturer l'ADN qui devient sous forme monocaténaire, lui fixer des amorces et le polymériser avec la Taq DNA polymérase. Les trois températures et leurs temps d'application sont gérées par un thermocycleur.
1. Polymorphisme d'amplification aléatoire de l'ADN. Technique RAPD.
La
technique RAPD est basée sur la méthode PCR. L'amplification
du DNA génomique est, cette fois ci, réalisée à
partir d'amorces de séquences aléatoires (10 bases, environ),
utilisées seules ou par couples. Lorsqu'une seule amorce aléatoire
est utilisée, l'amplification a lieu une fois celle ci se fixe
sur 2 sites complémentaires peu distants (maximum théorique
de la PCR : 3000 pb).
Origines du polymorphisme de type 'RAPD'
Les causes du polymorphisme de type RAPD sont:
- Disparition par mutation (mutation ponctuelle, crossing-over, insertion, délétion, ...) d'un ou plusieurs sites de fixation de l'amorce.
- Eloignement, par insertion, des sites de fixation de l'amorce à une distance supérieure à 3000 pb. Il en résulte la disparition de fragments de DNA.
- Rapprochement, par délétion, des sites de fixation de l'amorce à une distance inférieure ou égale à 3000 pb. Il en résulte l'apparition de fragments surnuméraires.
- Rapprochement très accusé des sites de fixation de l'amorce ne donnant lieu qu'à de petits fragments de DNA n'apparaissant pas sur le gel après électrophorèse.
Il
apparaît donc que les marqueurs RAPD sont en général
dominants, contrairement aux marqueurs RFLP. Ainsi, tous les individus
d'une génération F1, résultant d'un croisement de
2 lignées dont l'une possède un marqueur RAPD caractéristique,
présentent le même marqueur (la présence d'un marqueur
l'emporte sur son absence).
2. Marqueurs de type 'microsatellites' (SSR)
Les
microsatellites ou SSR (Morgante, Olivieri, 1993). Ils sont constitués
de séquences de di-, tri- ou tétra-nucléotides répétés
en tandem. Ces éléments sont uniformément répartis
en plusieurs exemplaires sur l'ensemble du génome d'une espèce
et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce
polymorphisme repose sur la variation du nombre d'unités de répétition
constituant le microsatellite. Les séquences flanquant ces
éléments répétés permettent de définir
les amorces qui seront utilisées pour l'amplification PCR. L'analyse
des produits amplifiés s'effectue sur gel d'acrylamide. C'est la
paire d'amorces spécifiques des bordures droite et gauche du microsatellite
qui constitue le marqueur.
Si les SSR constituent de bons marqueurs moléculaires (reproductibles,
codominants et aisés d'utilisation), leur caractérisation
initiale est toutefois assez lourde. En effet, leur production doit passer
d'abord par le clonage et le séquençage de ces éléments
répétés.
Marqueurs moléculaires basés sur la restriction de l'ADN et l'amplification par PCR
Marqueurs de type 'AFLP'
La technique AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al., 1995) est fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de sites de restriction et d'hybridation d'amorces arbitraires. Cette technique utilise à la fois les enzymes de restriction et l'amplification PCR. On distingue les étapes suivantes :
-
L'ADN génomique est coupé par deux enzymes de restriction.
- Des adaptateurs de séquences connues et spécifiques des
enzymes de restriction utilisées, sont ajoutés aux extrémités
des fragments de restriction générant ainsi une matrice
pour l'amplification.
- Une première amplification (pré-amplification) est réalisée
à l'aide d'amorces de séquences complémentaires à
la séquence des adaptateurs et des sites de restriction.
- La deuxième amplification (amplification sélective) utilise
des amorces identiques aux premières mais prolongées à
l'extrémité 3' de quelques nucléotides arbitraires
(de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont amplifiés
les fragments possédant les bases complémentaires de ces
bases arbitraires. Ces amorces sélectives permettent de réduire
le nombre de fragments amplifiés à une centaine.
- Ces fragments sont séparés par électrophorèse
sur gel d'acrylamide dénaturant puis visualisés par coloration
au nitrate d'argent ou révélés grâce à
un marquage radioactif ou fluorescent réalisé lors de l'amplification
sélective.
C'est la combinaison enzyme de restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme entre les individus. Elle constitue donc le marquage de type AFLP (voir fig.).
Liens utiles:
Isoenzymes-mutations
: http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-mutations.pdf
Isozymes. Principe de détection : http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-detection.pdf
Isozymes : loci, allèles : http://www.takween.com/techniques/isoenzymes-loci-alleles.pdf
RFLP : http://www.takween.com/techniques/10_RFLP.pdf
RAPD : http://www.takween.com/techniques/11_RAPD.pdf
AFLP : http://www.takween.com/techniques/13_AFLP.pdf
SSR (microsatellites) : http://www.takween.com/techniques/microsatellites-SSR-marqueurs.pdf
marqueurs moléculaires PCR