biotechnologies, diversité génétique, biodiversité et environnement
Accueil --- Biotechnologies classiques et modernes ----- Biodiversite ---- Diversité génétique (mesures) --- Environnement --- Amélioration génétique des plantes --- Techniques --- Techniques-video --- Annonces --- Newsletter --- Tests des connaissances --- Manifestations scientifiques --- Liens --- E-books --- Contact ---
Marqueurs moléculaires basés sur la PCR

Le développement de la technique PCR offre l'avantage d'analyser les marqueurs moléculaires en un temps court tout en utilisant des concentrations faibles d'ADN. Les marqueurs basés sur la technique PCR tendent à remplacer les systèmes classiques (les marqueurs morphologiques, isoenzymatiques et RFLP) et deviennent très nombreux et diversifiés.


Liens utiles: - Amélioration génétiques des plantes allogames -- Sélection Assistée par Marqueurs (MAS) -- Autogames, allogames. Exercice -- Sélection des plantes autogames. Exercice -- Sélection des plantes allogames. Exercice --- RFLP et sélection des protoplastes chez l'oranger. Examen S5_2012 -- RAPD et amélioration de la tomate pour la résistance à la verticilliose, RFLP. Examen S5_2012 -- RFLP, RAPD et sélection chez le Cyprès du Japon (examen 2013) -- SSR (microsatellites) et mildiou de la tomate (Examen S5, 2013) --- Marqueurs PCR de type RAPD et microsatellites chez coton (Contrôle S5, 2014) --
Marqueurs moléculaires basés sur la PCR
Contrairement aux marqueurs moléculaires de type 'RFLP' résultant de la restriction de l'ADN, les marqueurs moléculaires basés sur la PCR concernent les sites de fixation d'amorces ADN. La technique PCR consiste à dénaturer l'ADN qui devient sous forme monocaténaire, lui fixer des amorces et le polymériser avec la Taq DNA polymérase. Les trois températures et leurs temps d'application sont gérées par un thermocycleur.

PCR. Polymérisation de l'ADN

Thermocycleur PCR

1. Polymorphisme d'amplification aléatoire de l'ADN. Technique RAPD.

La technique RAPD est basée sur la méthode PCR. L'amplification du DNA génomique est, cette fois ci, réalisée à partir d'amorces de séquences aléatoires (10 bases, environ), utilisées seules ou par couples. Lorsqu'une seule amorce aléatoire est utilisée, l'amplification a lieu une fois celle ci se fixe sur 2 sites complémentaires peu distants (maximum théorique de la PCR : 3000 pb).

Marqueurs moléculaires

Origines du polymorphisme de type 'RAPD'

Les causes du polymorphisme de type RAPD sont:

- Disparition par mutation (mutation ponctuelle, crossing-over, insertion, délétion, ...) d'un ou plusieurs sites de fixation de l'amorce.

- Eloignement, par insertion, des sites de fixation de l'amorce à une distance supérieure à 3000 pb. Il en résulte la disparition de fragments de DNA.

- Rapprochement, par délétion, des sites de fixation de l'amorce à une distance inférieure ou égale à 3000 pb. Il en résulte l'apparition de fragments surnuméraires.

- Rapprochement très accusé des sites de fixation de l'amorce ne donnant lieu qu'à de petits fragments de DNA n'apparaissant pas sur le gel après électrophorèse.

Il apparaît donc que les marqueurs RAPD sont en général dominants, contrairement aux marqueurs RFLP. Ainsi, tous les individus d'une génération F1, résultant d'un croisement de 2 lignées dont l'une possède un marqueur RAPD caractéristique, présentent le même marqueur (la présence d'un marqueur l'emporte sur son absence).


Recherche rapide dans ce site et les sites liés de l'auteur (Fr, Ar, Eng) - بحث سريع في هذا الموقع و المواقع المرتبطة للمؤلف


QCM, Exercices, Examens en Sciences de la Vie-Biochimie dans le livre (+ CD), Arabe et Français:

sciences de la vie-Biochimie. Livre


2. Marqueurs de type 'microsatellites' (SSR)

Les microsatellites ou SSR (Morgante, Olivieri, 1993). Ils sont constitués de séquences de di-, tri- ou tétra-nucléotides répétés en tandem (toujours dans le même sens , par opposition à répétitions inversées répétées). Ces éléments sont uniformément répartis en plusieurs exemplaires sur l'ensemble du génome d'une espèce et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce polymorphisme repose sur la variation du nombre d'unités de répétition constituant le microsatellite. Les clones d'ADN qui s'hybrident facilement contiennent des séquences répétés. Pour que ce DNA marqueur puisse être un repère non ambigu, il doit être entouré à droite et à gauche de séquences uniques. Ces deux séquences flanquant les éléments répétés permettent de définir une paire d'amorces qui sera utilisée pour l'amplification PCR. L'analyse des produits amplifiés s'effectue sur gel de polyacrylamide haute résolution (susceptible de séparer des fragments d'ADN de taille faible). Un microsatellite (SSR) est donc défini par: 1/ le motif répété qui le compose et 2/ la paire d'amorces uniques qui l'encadrent et servent à l'identifier et à l'amplifier.
Si les SSR constituent de bons marqueurs moléculaires (reproductibles, codominants et aisés d'utilisation), leur caractérisation initiale est toutefois assez lourde. En effet, leur production doit passer d'abord par le clonage et le séquençage de ces éléments répétés.

Marqueurs moléculaires PCR. Microsatellites (SSR)

SSR multialléliques

Microsatellites. Allèles

Etant donné qu'il n'existe que de faibles différences de tailles sur les microsatellites, ces marqueurs sont souvent séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (au lieu de l'agarose). Exemples d'électrophorégramme:

Microsatellites

Examens: SSR (microsatellites) et détection d'hbrides somatiques Mandarinier x Citrange --- SSR et détection d'hbrides chez le cototon


Marqueurs moléculaires basés sur la restriction de l'ADN et l'amplification par PCR
Marqueurs de type 'AFLP'

La technique AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al., 1995) est fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de sites de restriction et d'hybridation d'amorces arbitraires. Cette technique utilise à la fois les enzymes de restriction et l'amplification PCR. On distingue les étapes suivantes :

- L'ADN génomique est coupé par deux enzymes de restriction.
- Des adaptateurs de séquences connues et spécifiques des enzymes de restriction utilisées, sont ajoutés aux extrémités des fragments de restriction générant ainsi une matrice pour l'amplification.
- Une première amplification (pré-amplification) est réalisée à l'aide d'amorces de séquences complémentaires à la séquence des adaptateurs et des sites de restriction.
- La deuxième amplification (amplification sélective) utilise des amorces identiques aux premières mais prolongées à l'extrémité 3' de quelques nucléotides arbitraires (de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont amplifiés les fragments possédant les bases complémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorces sélectives permettent de réduire le nombre de fragments amplifiés à une centaine.
- Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide dénaturant puis visualisés par coloration au nitrate d'argent ou révélés grâce à un marquage radioactif ou fluorescent réalisé lors de l'amplification sélective.

C'est la combinaison enzyme de restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme entre les individus. Elle constitue donc le marquage de type AFLP (voir fig.).

AFLP. Restriction et amplification de l'ADN


-

marqueurs moléculaires PCR