biotechnologies, biodiversité des plantes

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Transgénèse chez les plantes. Caractérisation des transformants et évaluation des plantes transgéniques

La caractérisation moléculaire ainsi que la caractérisation biochimique des transformants issus de la transgénèse reposent respectivement sur la PCR et l'ELISA. L'évaluation des plantes transgéniques est réalisée par des hybridations.

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- Tests de caractérisation moléculaire et biochimique des transformants
--- Caractérisation moléculaire des transformants et vérification de l'intégration du transgène.
--- Caractérisation biochimique des transformants et test de l'expression du transgène.
- Evaluation de la valeur agronomique de la plante
Tests de caractérisation moléculaire et biochimique des transformants

La caractérisation moléculaire permet de s'assurer qu'une plante sélectionnée par sa résistance à un agent de sélection (herbicide ou antibiotique), a bien intégré le gène d'intérêt dans son génome. Les sites d'intégration du gène et le nombre de copies intégrées dans le génome doivent être déterminés. Ces paramètres peuvent, par la suite, influencer le niveau d'expression du gène.
Enfin, la caractérisation biochimique, cette fois, permet de s'assurer que le gène introduit s'exprime et produit la protéine désirée, en quantité suffisante. A cette étape, de nombreuses plantes transgéniques seront éliminées par défaut d'expression du gène d'intérêt.

Caractérisation moléculaire des transformants et vérification de l'intégration du transgène.

Après transformation d'une plante, il est important de déterminer si l'ADN transféré est bien intégré dans le patrimoine génétique de la plante. En effet, la sélection des cellules sur un milieu contenant l'agent de sélection n'est pas toujours fiable.

Tests de la présence ou absence du transgène et du nombre de copies intégrées par électrophorèse de l'ADN.

1/ Test de la présence ou absence du transgène par électrophorèse de l'ADN

- Tests par RFLP de la présence ou absence du transgène. On Utilisation des marqueurs RFLP (restriction fragment length polymorphism) où on vérifie la longueur des fragments de restriction avant et après transformation.

L'intégration d'un transgène peut entrainer la disparition d'un site de restriction et la diminition du nombre de fragments d'ADN séparés par électrophorèse.

L'ADN Sauvage (2) présente 2 sites de restrictions. Ceci donne 3 fragments.
L'ADN recombiné reflète l'insertion d'un transgène qui s'est intégré en plein milieu du gène du site de restriction (perte du site). Il en résulte une diminution du nombre de fragments d'ADN.

RFLP test

- Tests par PCR de la présence ou absence du transgène. Sur de faibles quantités d'ADN, la PCR (Polymerase Chain Reaction) ou réaction de polymérisation en chaîne, permet de détecter la présence éventuelle du transgène. Des amorces spécifiques au transgène permettent de déterminer si une plante porte le gène transféré ou non. Les fragments amplifiés sont rendus visibles par électrophorèse sur un gel (voir figure).


2/ Test du nombre de copies du transgène par RFLP et 'southern blotting'.

Analyse par la technique de Southern blotting: Pour se rendre compte du nombre de copies du transgène intégré dans les plantes, une analyse plus fine pourra être réalisée par hybridation moléculaire ADN-ADN, selon la technique de 'Southern blotting'. L'ADN total de la plante est digéré séparément par différentes enzymes de restriction. Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. Après transfert des fragments d'ADN sur une membrane nitrocellulose, l'hybridation par une sonde marquée (correspondant à tout ou une partie du gène transféré) permet de déterminer le nombre de copies du transgène intégrées au génome de la plante. Il faut choisir une enzyme qui coupe une fois dans le transgène et utiliser une sonde se fixant à une des extrémités du transgène et surtout pas au niveau du site de restriction.

Transgénèse. Caractérisation moléculaire

Les plantes B et D contiennent le transgène. B en possède une seule copie et D trois copies.


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3/ Test du nombre de copies du transgène et détermination de son site d'insertion par PCR inverse. Cette technique de biologie moléculaire sert à amplifier une séquence inconnue. Elle est réalisée en 3 étapes: 1/ Insérer une séquence connue au milieu de la séquence inconnue à amplifier; 2/ Couper la séquence inconnue avec une enzyme de restriction et lier les extrémités par une ligase pour rendre circulaires les fragments d'ADN et 3/ Couper la séquence connue par une enzyme de restriction connue, et démarrer la PCR avec pour amorce la séquence connue (voir détail sur inverse PCR). Avec la PCR inverse; on peut se rendre compte où le transgène s'est inséré. En effet, l'inconvenient de la PCR conventionnelle et l'exigence de deux amorces devant être fixées aux extrémités du gène à amplifier. Avec un gène connu positionné à côté du gène inconnu, on peut créer à partir du premier ces deux amorces pour amplifier le gène inconnu.

2/ Tests de présence du transgène par la technique dot-blot d'hybridation ADN-ADN

La technique dot-blot consiste à détecter et quantifier un fragment d'ADN donné sans digestion et séparation préalable sur gel d'électrophorèse par leur hybridation à des ADN complémentaires marqués par un radioisotope (sonde). Cette technique exige d'une gamme pour quantifier (déterminer nombre de copies). DNA dot-blot

Le Principe est similaire à la technique 'Southern-Blot'. La technique dot-blot nécessite de grandes quantités d’ADN purifié qui est fixé sur une membrane par aspiration. Des sondes radioactives (transgène ou transgène + vecteur) sont utilisées dans l'hybridation. La quantification peut être réalisée par scintillation ou par autoradiographie et densitométrie.


Test par RT-PCR de l'expression du transgène au niveau de la transcription en ARNm

Pour se rendre compte si le transgène s'exprime, la PCR reverse (RT-PCR) sera utilisée. Cette technique permet de vérifier la présence d'ARN messager, transcrit spécifiquement à partir du transgène.


Caractérisation biochimique des transformants et test de l'expression du transgène (traduction en protéine).

- Test ELISA. Lorsque le gène s'intègre dans le génome, on ne peut maîtriser son endroit, c'est tout à fait aléatoire. Quand il s'introduit, il peut se mettre juste avant les codons de terminaison ou dans une zone de grande expression.
Si le gène code pour une enzyme, on mesure l'activité enzymatique de cette enzyme et on la compare à celle du témoin.

 

Une fois la présence du nouveau gène (transgène) dans la plante est bien vérifiée, il devient nécessaire de déterminer si ce gène produit ou non la protéine désirée et en quelle quantité.

Pour tester la présence et l'activité de la protéine, on réalise souvent un test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) qui est une méthode visuelle de détection de la présence de la protéine. Pour cela, des extraits de protéines sont préparés à partir des tissus des plantes transformées.
ELISA. Caractérisation transgènes
Ces protéines établissent une liaison spécifique avec un anticorps anti-protéine cible préalablement fixé sur les des puits d'une plaque ELISA. Un deuxième anticorps spécifique de la protéine, couplé à une enzyme (comme la peroxydase), est ajouté dans le milieu. Si la protéine correspondante au transgène est présente, il se forme un complexe anticorps-protéine-anticorps. En ajoutant le substrat de l'enzyme on obtient un produit coloré visible témoignant de la présence du produit d'expression du transgène. Un lecteur de plaque ELISA permet de mesurer l'activité de l'enzyme. Les puits de la plaque ELISA restés clairs renseignent sur l'absence de production de la protéine résultante de l'expression du transgène.

- Test dot blot d'immunodétection. Les protéines extraites des transformants, sont déposées sur une membrane nitrocellulose et la protéine codée par le transgène est révélée par immunodétection en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine sur lequel se fixe un ani-anticorps marqué par une enzyme dont on peut mettre en évidence par un produit coloré résultant de son activité sur un substrat fourni.

Transgène. Protéine dot blot

Evaluation de la valeur agronomique de la plante

Des tests en serre et en champs sont réalisés pour étudier le comportement général de la plante transgénique, le niveau et la stabilité de l'expression du caractère dans différentes conditions de culture (seules quelques plantes sont retenues). Il s'agit de vérifier si le transgène gène introduit confère le caractère souhaité et si son activité n'interfère pas avec le métabolisme général de la plante. Enfin, il faut caractériser la transmission du caractère à la descendance.

Introgression dans une lignée commerciale élite

La plante qui a intégré le transgène est retenue. Elle constitue la lignée mère. Cependant, cette plante n'est pas encore la variété commerciale. En effet, l'efficacité de transformation et de régénération étant dépendante du génotype, la plante qui a été transformée est d'un génotype facilitant ces étapes. Le transgène doit être transféré dans une lignée commerciale élite par rétrocroisements. Au cours de ces générations d'hybridation, on ne conserve que le gène d'intérêt et on élimine le reste du patrimoine génétique de la lignée mère. Autrement dit, on vide la lignée mère de touS ses gènes tout en gardant le transgène et on la remplit des gènes de la variété élite. Le résultat de ce processus est l'obtention d'une lignée quasiment identique à la lignée élite, mais contenant le nouveau caractère transgénique. La variété transgénique obtenue sera alors proposée à l'inscription.

croisement backcross

Ainsi, l'obtention d'une variété OGM est le fruit de nombreuses années d'expérimentations et d'analyses.

QCM Cocher la ou les bonnes réponses

Une plante appartenant à une variété transgénique
? exprime un caractère provenant d'une espèce différente
? peut transmettre sa modification à ses descendants.
? peut s'hybrider avec une variété non transgénique
? a été produite par culture in vitro.

La création d'une nouvelle variété par transgénèse
? s'appuie sur la reproduction sexuée des végétaux
? est une méthode que l'on peut qualifier d'empirique
? est à l'origine d'individus possédant le même génotype
? peut s'apparenter à une hybridation

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