Transgènes chez les plantes. Etapes


La transgénèse comporte plusieurs étapes dont 1/ Identification, isolement, intégration et multiplication d'un gène d'intérêt, 2/Transfert du gène d'intérêt, 3/ Régénération et évaluation des plantes transformées et 4/ Etape 4 : Incorporation du transgène dans une variété commerciale et obtention d'une 'variété OGM'

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QCM Biotech

Etapes de la transgénèse chez les plantes

Etapes de la transgénèse Outils et techniques associés
1/ Repérage d'un caractère intéressant dans une espèce donneuse: (bactéries, champignon, plante...). Examen du génome
Cartographie du génome
Séquençage
2/ Identification de la protéine responsable de ce caractère (ex : protéine toxique pour un insecte ravageur).
3/ Identification et isolement du gène d'intérêt Obtention d'un mélange de fragments d'ADN. Enzyme de restriction.
Southern blot
4/ Réalisation et amplification d'une construction génique
- Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide
- Introduction du plasmide modifié dans le génome de la cellule hôte.
Construction génique
Clonage d'un gène.
5/ Transfert de l'ADN dans l'espèce receveuse
Introduction d'un ADN étranger ou remplacement d'un fragment d'ADN
- Vecteurs biologiques (bactéries, virus)
- Recombinaison homologue
- Fusion utilisant des liposomes
- Transfection
- Utilisation du polyéthylène glycol (PEG)
- Micro-injection in vitro
- Electroporation
- Canon à particules
6/ Contrôle de l'efficacité du transfert chez l'hôte par détection directe des transgènes Hybridation in situ
PCR
Sélection des cellules exprimant le gène ajouté par tri Gène de sélection
Gènes rapporteurs

Transgénèse. Etapes

Etape 1 : Identification, isolement, intégration et multiplication d'un gène d'intérêt


La première étape est l'identification chez une espèce donneuse d'un caractère d'intérêt (résistance à certains insectes, à certaines maladies, à des herbicides, qualité nutritionnelle…) que l'on souhaite introduire dans une plante (espèce receveuse). Le gène d'intérêt peut provenir de tout organisme vivant, bactérie, plante ou animal puisque le code génétique est universel. Ce gène doit être isolé de l'organisme donneur. Il est intégré dans une construction génétique associant souvent un gène marqueur. Ce dernier permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le gène d'intérêt. La construction est ensuite multipliée (clonage) afin d'en disposer d'une quantité suffisante d'ADN pour son introduction dans les cellules végétales que l'on veut transformer.


Caractère recherché

Plante transformée (OGM)

Résistance aux insectes:
Les plantes transgéniques produisent leur propre toxine Bt. Les toxines sont dites Bt car naturellement produites par des bactéries, Bacillus thuringiensis que l'on trouve dans le sol. Il y a plusieurs variantes de protéines Bt (toxine cry) conférant ainsi des résistances à des insectes spécifiques. La protéine Cry1Ab confère une résistance contre certains papillons.

- Maïs-grain Bt résistant à la pyrale
- Pomme de terre Bt résistante au doryphore de la pomme de terre
- Tomate Bt résistante aux lépidoptères

Résistance aux herbicides:

La plante transgénique produit une nouvelle protéine qui annule l'effet
toxique de l'herbicide dans la plante génétiquement modifiée (PGM), La protéine normalement ciblée par l'herbicide est remplacée par une nouvelle protéine non sensible à l'herbicide

- Maïs-grain
- Soja
- Lin
- Colza
- Coton
- Betterave sucrière
- Luzerne
- Riz

Maturation retardée:

- Tomate

Changement de la composition nutritionnelle:
- Augmentation de la teneur en vitamine A
- Augmentation de la teneur en lysine, acide aminé essentiel

- Riz doré
- Maïs


Comment isole-t-on le gène d'intérêt?

- ADN Génomique provenant d'une banque d'ADN génomique (voir TD)
- ADN complémentaire (cDNA) résultant de l'ARN messager (mRNA) (voir TD)


Etape 2 : Transfert du gène d'intérêt


Il y a plusieurs méthodes pour introduire un gène dans une cellule :
- Transfert direct
Cette technique fait intervenir :
- Transfert par bombardement par un canon à particules (biolistique). Une projection d'ADN dans les cellules de la plante par l'utilisation d'un canon à particules qui projette dans les cellules des microparticules enrobées d'ADN (biolistique)

تقنية المسدس الجينى - Gene gun technique - طريقة لقذف الخلايا النباتية بالمادة الوراثية بعد تغليفها لجسيمات معدنية فلزية مثل كريات الدهب. تقدف الجسيمات بسرعة علية لتخترق جذار الخلايا و تنقل المورث المرغوب

- Transferts chimiques:
l'ADN peut être mélangé avec des lipides sous forme de liposome. La bicouche membranaire fusionne avec le liposome et l'ADN passe dans la cellule. Une autre méthode consiste à précipiter l'ADN avec du phosphate de Calcium qui sera plus facilement internalisé dans la cellule.

biolistique, électroporation

- Transfert sur protoplastes par fusion en présence du polyéthyléneglycol (PEG, méthode chimique). L'introduction d'ADN dans des protoplastes est réalisée par action d'un agent chimique, le polyéthyléneglycol (PEG), une molécule capable d'induire la déstabilisation de la membrane plasmique permettant le transfert d'ADN à travers celle-ci.
-Transfert sur protoplastes par électroporation (impulsion électrique). L'électroporation des protoplastes, technique efficace et une des plus simples à mettre en œuvre, consiste à soumettre un mélange de protoplastes et d'ADN à une série de chocs électriques de courte durée et de tension élevée. Le champ électrique provoque la déstabilisation de la membrane plasmique par polarisation des phospholipides qui la constituent et induit alors la formation de pores au travers desquels les molécules d'ADN peuvent transiter. Si le choc électrique n'a pas été trop violent, le phénomène est réversible et la membrane reprend ensuite son état initial, laissant le protoplaste parfaitement viable.
Limites : les techniques appliquées aux protoplastes végétaux sont actuellement valables uniquement chez les espèces dont on maîtrise la culture et la régénération de plantes à partir des protoplastes. Les progrès des méthodes de culture in vitro ont permis à des plantes comme le riz d'être transformées à l'aide d'Agrobacterium. Pour les espèces dont on ne maîtrise pas la régénération des plantes en culture in vitro, on utilise le transfert direct du gène d'intérêt.

- Transfert indirect par transformation biologique (coculture)

Chez les plantes, cette technique utilise une bactérie du sol, Agrobacterium, qui a la propriété de réaliser naturellement la transformation génétique d'une plante, afin de la parasiter. Ainsi, une construction génétique introduite dans la bactérie (rendue avirulente au préalable) sera transférée dans la plante et intégrée à son génome. C'est la technique la plus couramment utilisée.
La transformation génétique est réalisée en mélangeant la culture d'une souche d'Agrobacterium transformée (et préalablement sélectionnée par culture in vitro sur les milieux appropriés), mise en suspension en milieu liquide, avec des explants de la plante, on parle de coculture.

Transformation coculture

C'est au cours de cette étape que la construction génétique introduite dans la bactérie est transférée dans le génome de la plante.
Lors de la transformation, on utilise des disques foliaires, des sections de tige, des cotylédons, des embryons, des microspores ou des protoplastes. Par exemple, chez le tabac et la tomate, on utilise des disques foliaires ; chez la pomme de terre, la transformation génétique peut se faire sur des protoplastes.
La co-culture doit permettre l’activation de la virulence des bactéries. Ainsi, le pH induisant la virulence des bactéries est souvent plus acide (pH inférieur à 5,7) que celui de milieux utilisés pour la culture des végétaux (5,7-5,8). Aussi, certains sucres sont connus pour stimuler la virulence, et pourront être ajoutés au milieu de co-culture. Parfois, le milieu de co-culture doit contenir des composés phénoliques activateurs de la virulence comme l’acétosyringone (voir image composite sur une nouvelle page).
Arrêt de la co-culture : élimination des agrobactéries
Une fois le transfert de gènes dans les cellules végétales à partir des bactéries ait lieu (quelques heures de co-culture) il faut éliner les bactéries restantes. En effet, leur prolifération limite celle des cellules végétales transformées. Il existe plusieurs techniques pour les éliminer dont l'utilisation des bactériostatiques et des antibiotiques, méthodes plus répandues pour l'élimination des bactéries après la phase de co-culture et sans effet sur les cellules végétales.
La majorité des plantes monocotylédones, dont les céréales, resteréfractaire à la transformation par les agrobactéries. Cette limitation importante avait conduit au développement de procédés de transfert direct, mais également à mieux affiner encore l’utilisation des agrobactéries.


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Etape 2 : Transfert du gène d'intérêt (suite)


Le transfert de gène dans les organites cellulaires

Deux organites cellulaires, les mitochondries chez les animaux et les chlorophastes chez les plantes sont des cibles pour le transfert de gène. Des fragments d'ADN étranger peuvent être transférés dans des mitochondries isolées, et les mitochondries peuvent être introduites par microinjection dans des cellules hôtes. Ceci peut permettre d'étudier le rôle du génome mitochondrial. Le transfert de gène dans les chloroplastes présente davantage d'intérêt, pour plusieurs raisons. La première est que le génome chloroplastique contient beaucoup plus de gènes que celui des mitochondries. Il existe par ailleurs 10 000 chloroplastes par cellule, environ. Le transfert de gène dans les chloroplastes est possible, et les plantes qui en résultent sont qualifiées de transplastomiques. L'ADN étranger peut être introduit par biolistique, par une transfection à l'aide du polyéthylèneglycol ou par un système particulier de microinjection. L'ADN étranger peut s'incorporer dans le génome chloroplastique par recombinaison homologue. Outre l'étude du génome chloroplastique, le transfert de gène ainsi pratiqué permet une expression très intense des transgènes, jusqu'à 100 fois plus que celle obtenue avec le même gène incorporé dans le génome principal. Ce fait est évidemment dû essentiellement au grand nombre de chloroplastes que contient chaque cellule. Les chloroplastes, comme les mitochondries, sont par ailleurs d'origine maternelle. Le pollen ne transmet donc pas le gène étranger incorporé dans les chloroplastes. Ceci offre une sécurité très élevée pour l'environnement, quoique celle-ci ne soit pas totale dans la mesure où quelques chloroplastes paternels se retrouvent parfois dans le zygote, comme c'est le cas pour quelques mitochondries.


Séléction des cellules et tissus transformés



Etape 3 : Régénération et évaluation des plantes transformées.


Après sélection des cellules transformées, il faut régénérer les nouvelles plantes transgéniques. Les cellules transformées se développent d'abord en cals, larges amas de cellules indifférenciées. Après quelques semaines, on observe le développement de pousses. Elles sont alors placées dans un nouveau milieu de culture permettant le développement des racines. Quand les racines sont suffisamment développées, les plantules sont repiquées en pot et acclimatées en serre.
La régénération in vitro des cellules transformées est une étape difficile à maîtriser.

Plante transgénique. Régénération

Aussi, le génotype, le type de tissus et les conditions de culture sont choisis en fonction de leur aptitude à la régénération. Les plantes régénérées sont ensuite analysées pour confirmer l'insertion de la construction génétique dans leur génome. Des analyses moléculaires sont conduites dans ce sens. Des études sur l'expression du gène ont lieu à plusieurs stades, ce qui permet de caractériser le niveau d'expression et le comportement de la plante exprimant le nouveau caractère.


Conditions du succès de la transgenèse végétale :

Le succés de la transgenèse végétale est lié à plusieurs conditions qui doivent être réunies simultanément :
- Pénétration de l'ADN étranger dans les noyaux des cellules végétales ;
- Intégration dans le génome de l'hôte, c'est à dire dans un des chromosomes afin que le transgène puisse se répliquer et devenir stable au sein du génome nucléaire et ainsi être transmis aux cellules filles ;
- Aptitude des transgènes à être exprimés, suite à la transcription en ARN dans le noyau et à la traduction en protéine dans le cytoplasme ;
- Sélection et régénération de plantes entières à partir des cellules génétiquement modifiées. La sélection s'éffectue grâce à un gène marqueur (aussi présent sur l'ADN-T) conférant la résistance à un antibiotique toxique (ou à un herbicide) pour la cellule végétale transformée.
Pour être qualifiée de transgénique il faut que toutes les cellules de la plante possède le transgène sinon, il s'agit d'une plante chimère.


Etape 4 : Incorporation du transgène dans une variété commerciale et obtention d'une 'variété OGM'


Les plantes transformées obtenues sont soumises à des croisements contrôlés pour étudier les modalités de transmission du nouveau caractère à la descendance.

La transformation et la régénération étant des opérations délicates, le génotype de la plante choisie est celui facilitant ces étapes. C'est pourquoi les plantes retenues sont ensuite soumises à une succession de rétrocroisements afin d'introduire le gène dans le matériel élite et d'obtenir de nouvelles variétés commerciales exprimant ce caractère.


Obtention d'une variété OGM


Lors de la transformation génétique, une, deux ou plusieurs copies du gène peuvent s'insérer à différents endroits sur les chromosomes. Ainsi, chaque cellule transformée pourra donner une plante différente. Ce sont autant d'événements de transformation.

variété OGM

Liens utiles :
make transgenic cell


Avantages et inconvénients des organismes génétiquement modifés:
- Les risques de pollution génétique par le flux des gènes. L'autre face des plantes transgéniques dans l'agriculture de demain

- Le flux des transgènes et son impact sur l'environnement
- Nos attitudes vis à vis des OGM (Maghreb, Ar)



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