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Culture in vitro. Marqueurs biochimique et moléculaire des obtentions de la culture

Les marqueurs biochimique et moléculaire des obtentions de la culture in vitro (cals, embryons somatiques, tissus embryogenèse, protoplasle fusionnes, ..) permettent la détection précoces des formations obtenues par la culture des tissus et des cellules lors de la production de vitro-plants.

Les marqueurs biochimiques et moléculaires peuvent être de nature protéines, enzymes, acides nucleiques (ADN, RNA) et produits finaux des réactions.


Partie 1: Marqueurs biochimiques et moléculaires. Rappel

- Marqueurs de type 'Proteines' et isoenzymes'
- Marqueurs de type ADN:
------- Marqueurs de type RFLP
------- Marqueurs bases sur la PCR: RAPD, AFLP

marqueurs moléculaires


Partie 2: Marqueurs biochimiques et moléculaires des obtentions de la culture in vitro.

1. INTRODUCTION
2. ORIGINES DE LA VARIABILITE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE IN VITRO
2.1.
Variations chromosomiques
2.2. Variations géniques
2.3. Modifications épigéniques


3. MARQUAGE BIOCHIMIQUE ET MOLECULAIRE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE IN VITRO
3.1. Differents types de marqueurs:
------ Marquages de types proteines, enzymes, RNA, ADN, produits finaux des réactions
3.2. Exemples de marquages chez les vitro-plantes
------ Marqueurs moléculaire de l'embryogenèse somatique chez le palmier dattier (Phoenix dactylifera L).
------ Marqueurs des modifications épigéniques chez le fraisier
------ Marquages des hybridations somatiques

1. INTRODUCTION.

La culture in vitro reste un moyen de multiplication végétative extrêmement puissant. Un seul méristème peut permettre d'obtenir, en une année de l'ordre de un million de vitro-plants. Cependant, il est encore difficile de reconnaître facilement le matériel végétal en tube. Les premières précautions à prendre est d'éviter tout risque d'erreurs dans les varietes lors du prélèvement du meristeme. Bien que rares (fréquence = 10 puissance -6), des mutations peuvent naturellement se produire et permettre, ainsi, l'évolution à l'échelle du temps. Des variations génétiques ou physiologiques pourraient avoir lieu au cours des différentes phases de la culture in vitro. On se demande si les conditions de culture in vitro sont susceptibles de modifier la fréquence des mutations ou d'ajouter d'autres causes de variations. La cellule totipotente est susceptible de donner plusieurs plantes transformées suite à son exposition à des agents mutagènes ou une modification chromosomique ou genique.

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On peut distinguer 5 sources de variation:

- Variations somaclonales pouvant être induites par la culture in vitro
- Traitement mutagène (chimique ou physique)
- Culture de cellules à n chromosomes (microspores (anthères) ou ovules)
- Transformations génétiques (transfert de ADN étranger et obtention de plantes transgéniques)
- Addition de génome et de cytoplasme (fusion des protoplastes)

La variabilité engendrée par la culture in vitro est de deux ordres :

- Une variabilité non voulue pour la multiplication conforme de clones.

- Une variabilité voulue pour l'obtention de nouveaux génotypes. La variabilité non voulue reste un obstacle pour la multiplication conforme. En effet, celle ci doit assurer une stabilité génétique du matériel in vitro. Le domaine où cette condition est capitale est celui de la conservation des ressources génétiques, car, la mondialisation de l'agriculture s'accompagne de la disparition de certaines espèces et d'un grand nombre de variétés. Beaucoup de laboratoires expérimentent la conservation in vitro de nombreuses espèces à l'état de vie ralentie, dans des conditions de température -1°C à +5°C, selon les espèces. Ceci rentre dans le cadre de conservation ex-situ des ressources génétiques. après un délai d'environ un an, il faut procéder à un repiquage sur milieu neuf.

2. ORIGINES DE LA VARIABILITE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE IN VITRO

La variabilité des plants néoformés à partir de tissus ou de cellules cultivées in vitro a comme causes une modification du nombre de chromosomes, une mutation génique ou cytoplasmique ou un changement durable du mode de fonctionnement du génotype

- VARIATIONS CHROMOSOMIQUES. Les variations chromosomiques en culture in vitro (nombre de chromosomes) se produisent principalement dans la culture de cals indifférenciés ou les cultures cellulaires, tandis que les cultures de méristèmes conduisent à des plantes uniformes

- MUTATIONS GENIQUES. Les mutations géniques peuvent conduire, après culture in vitro, à l'apparition de phénotypes nouveaux, sans changement du nombre de chromosomes. Ce sont des 'variants'.

- MODIFICATIONS EPIGENIQUES. Les modifications épigéniques ou physiologiques peuvent concerner plusieurs caractères phénotypiques, comme la forme, la couleur des feuilles, ainsi que leur nombre et leur poids. Ces modifications, ne concernant pas le nombre de chromosomes, peuvent se traduire, également, par l'altération de la floraison, de l'expression du sexe, de la fertilité et du rendement. La majorité de ces comportements physiologiques sont de courte durée et peuvent résulter des chocs chimiques et physiques subit par le tissu en culture in vitro. Néanmoins, certains développements anormaux peuvent être mémorisés longtemps.

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3. MARQUAGE BIOCHIMIQUE ET MOLECULAIRE DES OBTENTIONS DE LA CULTURE IN VITRO.

En considérant l'asynchronie de la culture des tissus, le nombre de cellules impliquées dans le processus de la régénération est toujours très faible par rapport au nombre total des cellules de l'explant ou de la suspension cellulaire, surtout pendant les premières phases de la régénération. Les études biochimiques et Moléculaires concernent, souvent, la totalité du matériel. De ce fait, ces études doivent être accompagnées d'analyses de natures microscopiques et histochimiques.

3.1. Différents types de marqueurs.

Quatre grands types de marqueurs peuvent être distingués.

- Marqueurs de type ADN. Plusieurs auteurs ont rapporté une amplification précoce de l'ADN, survenant 1-20 heures après introduction en culture chez les dicotylédones. Cette étape est suivie par une activité mitotique pouvant être reliée à une dédifférenciation. Aux stades plus avancés, le contenu en ADN diminue à environ 50% du contenu cellulaire. Il a été montré, aussi, que le ADN répété est fortement réduit pendant la phase linéaire de la croissance des cals chez la carotte. Pendant la phase de croissance stationnaire (4 semaines de culture) des amplifications abondantes du ADN ont été, de même, montrées chez la même espèce. D'autre part, plusieurs études ont montré que le stade de dédifférenciation cellulaire est lié à une méthylation du ADN. Contrairement à la phase de croissance stationnaire du cal de carotte, la phase de croissance linéaire est caractérisée par une augmentation de la méthylation du ADN. D'autres travaux rapportent l'effet inducteur de la méthylation de l'ADN par l'auxine, comme hormone de croissance. Par contre, la kinétine tend à bloquer les changements dans la méthylation de l'ADN. Cette dernière est considérée, donc, comme marqueur de la dédifférenciation cellulaire.  

- Marqueurs de types RNA et protéines. Des changements typiques dans l'expression des gènes ont été rapportés pendant les stades précoces de la différenciation. Des corrélations ont été trouvées entre le taux des glycoprotéines sécrétées dans le milieu de culture et la différenciation des embryons somatiques.  

- Marqueurs de type enzymes. Plusieurs enzymes ont été décrites comme marqueurs de plusieurs phases de la régénération. Ainsi, les peroxydases sont utilisées pour le marquage de l'enracinement et l'embryogenèse somatique. Les estérases pour différencier les cals embryogènes et non embryogènes et les polyphénoloxydases pour l'embryogenèse en suspensions cellulaires

- Marqueurs de type produits finaux des réactions.

* Apparition de grains d'amidon de courte durée pendant les étapes précoces de la régénération des tiges et des embryons somatiques.
* Fluctuation du niveau d'AIA endogène pendant le processus d'enracinement.
* Augmentation des niveaux de polyamines (putrescine et spermine, en particulier) chez les cellules embryogènes et leur milieu de culture. L'inhibition de la réduction de la synthèse des polyamines réduit le nombre d'embryons. Leur addition restaure la formation d'embryons somatiques.
* Diminution du taux de l'éthylène et du glutathion chez les suspensions cellulaires embryogènes.
* Diminution de l'état redox (aptitude à la réduction du Fe3+) chez les cellules embryogènes
* Utilisation des contenus phénoliques comme marqueur de l'aptitude à la formation de racines.


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Vitro-plants. marqueurs moléculaires