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Marqueurs SSR (microsatellites) et transformation génétique (transgénèse). Examen du module biotechnologies et Amélioration des plantes

Marqueurs SSR (microsatellites) et transformation génétique (transgénèse). Examen du module biotechnologies et Amélioration des plantes


Les marqueurs SSR (microsatellites), basés sur la PCR, peuvent être utilisés pour établir les cartes génétiques (ici cas de la tomate). Ceci permet la sélection assistée par marqueurs pour le trait de la résistance au mildiou.
Examen de la matière 2 du module 'Biotechnologies et Amélioration des Plantes', Université Cadi Ayyad, Morocco, Juin 2017", Durée : 75 minutes .......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve


QUESTION 1


Afin de réaliser la cartographie génétique des traits de resistance au mildiou et des marqueurs moléculaires de types microsatellites (SSR), Zhu et et al., 2006 (Agr. Sci. China 5, 517-521) ont étudié la ségrégation du trait de la résistance au mildiou et huit marqueurs de types SSR, dont un correspondant à l'amorce TOM236 (marqueur TOM236). Pour atteindre ce but, les chercheurs ont suivi la ségrégation des traits de résistance et des marqueurs sur une population F2 provenant d'un croisement de plantes de la population F1, elles mêmes dérivant d'un croisement entre un génotype mâle résistant au mildiou (CLN2037E, parent P1) et une variété de tomate sensible (parent femelle, P2). Le test de la resistance des plantes a été réalisé par culture des plantes dans un champs infecté par Phytophthora infestans (trait de la resistance Ph-RoF). Des tests préalables ont montré que le caractère de la résistance au mildiou est dominant sur le caractère de la sensibilité. L'ADN a été purifié à partir de toutes les plantes P1, P2, et F2, a subit une amplification par PCR (polymérisation en chaîne de l'ADN) en présence d'amorces spécifiques pour un marquage de type SSR. Les fragments d'ADN obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 2,5% (p/v) et visualisés par le Bromure d'éthidium. L'électrophorégramme relatif aux marquage SSR résultant de l'utilisation de l'amorce TOM236, est représenté par la figure cidessous (M indique les marqueurs de la taille de l'ADN, S et R renseignent sur la sensibilité et la résistance des plantes au mildiou, séparément).

Microsatellites

1) Expliquer les raisons du choix des gels d'agarose 2,5% comme support de séparation par éléctrophorèse de l'ADN des plantes.
2) A l'aide d'un tableau, comparer les marqueurs moléculaires de tpe SSR et AFLP (étapes principales, enzymes utilisées, effet de l'environnement, reproductibilité, déterminisme de dominance-codominance).
3) En s'aidant de l'électrophorégramme, déduire la différence structurale susceptible d'expliquer la mobilité de l'ADN amplifié des plantes sensibles et résistantes au mildiou.
4) Comparer les génotypes à base des marqueurs SSR, obtenus avec l'amorce TOM236 et montrés par l'électrophorégramme chez les plantes de tomates, y compris les parents P1 et P2.


QUESTION 2


Le test de la transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens du Vigna unguiculata (Niébé, haricot à l'œil noir, cowpea, ..) pour produire des plantes transgéniques fertiles transmettant le transgène de façon mendélienne, a été réalisé par Chaudhury et al. (2007, Plant Sci. 172).
Niébé, Vigna unguiculata
Des explants cotylédonnaires ont été mis en culture in vitro sur milieu MS avec co-culture en présence d'Agrobacterium hébergant le vecteur binaire PCAMBIA2301 qui contient les gènes de la béta-glucuronidase (uidA) et de la néomycine phosphotransférase (nptII) (figure 1).

Vecteur binaire

Les plants résistants à la kanamycine sont enracinés sur milieur MS contenant du BAP. Les plants PCR-positifs au géne nptII, sont cultivés sur sol afin de collecter les graines. L'activité GUS a été testée au niveau des organes végétatifs et reproducteurs des plants parents et de la génération F1.
Les analyses moléculaires des transformants ont été réalisées sur les extraits d'ADN purifié par la méthode de CTAB. Deux amorces de 20 pb ont été utilisées dans les tests par PCR ciblant le gène nptII (fragment de 0.54 kb). L'électrophorèse a été réalisé sur gel d'agarose à 1% avec révélation au bromure d'éthidium. L'ADN préalablement digéré par HindIII a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,9% et détecté par hybridation avec une sonde correspondant à un fragment 0,75 kb correspondant au gène nptII.
Les analyses des transformants ont pu aboutir aux résultats montrés par la figure 2

Transgène. PCR, Southern blotting
Fig. 2

1. Quels sont les rôles des gènes uidA et nptII.
2. En se référant aux résultats relatifs aux analyses des plantes transformées (Fig. 2), spécifier l'expérience qui a montré l'insertion du gène codant pour la néomycine phosphotransférase (nptII).
3. Spécifier l'expérience qui renseigne sur le nombre de copies du transgène intégré dans les ADN des plantes. Déterminer ce nombre pour les plantes testées.
4. Quelle (s) expérience(s) possible(s) peuvent renseigner sur le(s) site(s) d'insertion du transgène dans le génome des plantes transformés.
5. Quelle (s) expérience(s) possible(s) peuvent renseigner sur la traduction du transgène intégré dans les plantes transformés.


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QUESTION 1. REPONSES


--- Revenir à la question 1
Réponse à la Question 1: les raisons du choix des gels d'agarose 2,5% comme support de séparation par éléctrophorèse de l'ADN des plantes.
L'agarose 0 2,5% utilisée dans la séparation de l'ADN par électrophorèse est considérée comme une concentration élevée. Son choix est motivé par la rétention des fragments d'ADN de taille faible résultant de la technique SSR et qui risquent de sortir du gel.
Lien utile : Electrophorèse
Réponse à la Question 2: comparaison des marqueurs moléculaires de tpe SSR et AFLP (étapes principales, enzymes utilisées, effet de l'environnement, reproductibilité, déterminisme de dominance-codominance).

  SSR AFLP
Nature des extraits de l'ADN ADN hautement purifié ADN hautement purifié
Etapes principales - Amplification de l'ADN en présence d'une paire d'amorces (20-40 nucléotides) et de la Taq DNA polymérase
- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide.
- Révélation par une méthode appropriée.
- Digestion de l'ADN par 2 enzymes de restriction (exemple MseI et EcoRI
- Fixation d'adaptateurs spécifiques des 2 enzymes de restriction
- Préamplification avec des amorces spécifiques de séquences complémentaires aux séquences des adaptateurs
- Amplification sélective avec des amorces identiques mais prolongées à l'extrêmité 3' avec 1 à 3 nucléotides.
- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
- Révélation de l'ADN par une méthode appropriée.
Enzymes utilisées - Taq DNA polymérase - Deux enzymes de restriction
- Ligase
- Taq DNA polymérase
Effet de l'environnement Non Non
Reproductibilité Elevée Moyenne
Caractère du marqueur (dominance/codominance) Codominant Dominant

Réponse à la Question 3: différence structurale susceptible d'expliquer la mobilité de l'ADN amplifié des plantes sensibles et résistantes au mildiou.

Le détail structural susceptible d'expliquer la différence de migration entre l'ADN amplifié des plantes sensibles et résistantes au mildiou réside dans le nombre de répétition du microsatellite. Les plantes de tomate résistantes au mildiou sont connues par un nombre de répétition faible (fragments d'ADN migrant rapidement vers l'anode, car de taille faible) par rapport aux plantes sensibles.

Réponse à la Question 4: Comparaison des génotypes à base des marqueurs SSR, obtenus avec l'amorce TOM236 et montrés par l'électrophorégramme chez les plantes de tomates, y compris les parents P1 et P2

Les parents P1 et P2 sont deux homozygotes différents. Les plantes resistantes au mildiou sont homozygotes et de même génotypes que le parent mâle P1, résistant. Les plantes sensibles sont de même génotype que le parent femelle, sensible.


QUESTION 2. REPONSES


--- Revenir à la question 2
Réponse à la Question 1: rôles des gènes uidA gène et nptII.
Le gène uidA (béta-glucuronidase) est un gène rapporteur. Le gène nptII (néomycine phosphotransférase) est un gène marqueur ou gène de sélection selon la résistance aux antibiotiques (kanamycine).
Réponse à la Question 2: Expérience qui a montré l'insertion du gène codant pour la néomycine phosphotransférase (nptII).
Expérience de la PCR (Fig. 2a), réalisée à l'aide de deux amorces de 20 pb ciblant le gène nptII (fragment de 0.54 kb).
Réponse à la Question 3: Expérience qui renseigne sur le nombre de copies du transgène intégré dans les ADN des plantes et nombre de copie pour les plantes testées.
Expérience 2 b (Southern blotting après digestion de l'ADN par HindIII, électrophorèse et révélation avec une sonde reconnaissant le gène nptII. Le nombre de copies du gène intégré (nptII) varie de 1 (plante 1) à 4 (plante 4). La plante 2 en possède 2).
Réponse à la Question 4: Expérience(s) possible(s) peuvant renseigner sur le(s) site(s) d'insertion du transgène dans le génome des plantes transformés.
- PCR inverse
Réponse à la Question 5: Expérience(s) possible(s) peuvent renseigner sur la traduction du transgène intégré dans les plantes transformées.
1/ Mesure de l'activité enzymatique correspondante au gène rapporteur (ici le gène uidA (béta-glucuronidase), 2/ ELISA, 3/ Test dot-blot d'immunodétection.


LIENS UTILES

- BIOTECHNOLOGIES. TEST DES CONNAISSANCES
- Modes de reproduction des plantes (autogames, allogames)
-Reproduction asexuée
- Polyploïdisation, Haploïdisation des plantes
- Amélioration génétiques des plantes autogames
- Amélioration génétiques des plantes allogames
- Sélection Assistée par Marqueurs (MAS)
- Autogames, allogames. Exercice
- Sélection des plantes autogames. Exercice
- Sélection des plantes allogames. Exercice
- RFLP et sélection des protoplastes chez l'oranger. Examen S5_2012
- RAPD et sélection de la tomate. Examen S5_2012
- Microsatellites (SSR) et MAS chez la tomate. Examen 2013
- Microsatellites. Détection d'hybrides orangier (Citrus sinensis) x mandarinier (Citrus reticulata). Contrôle de rattrapage 2017
-Isoenzymes. Mutations
-Isoenzymes. Mutations
- Isozymes. Principe de détection
- Isozymes: loci, allèles
- RFLP
- RAPD
- AFLP
- SSR (microsatellites)


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- Cours du Master Biotechnologies et Amélioration des Plantes, Marrakech
- Travaux pratiques Master Biotechnologies et Amélioration des Plantes, Marrakech
- Master course 'Plant resistance against pathogens'

Adresse

Faculty of Sciences, Cadi Ayyad University
Marrakech, 40000, Morocco

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Email: baaziz@uca.ac.ma
Phone: 212524434649 (post 513)
Fax: 212524434669

Marqueurs SSR (microsatellites), transgénèse, tomate