RAPD et sélection assistée par marqueurs (MAS) chez la tomate, technique RFLP. Examen de module
Les
marqueurs moléculaires RAPD
(basé sur la PCR) et RFLP
(restriction de l'ADN) peuvent être d'un grand intérêt
dans la sélection assistée par marqueurs, comme dans
le cas de l'amélioration pour la résistance de la
tomate à la verticilliose.
Examen de l'élément de module 'Génétique
et Amélioration des plantes'' (partie 'marquage moléculaire
et amélioration des plantes'), module 'Biochimie, Génétique
et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée
aux Productions Végétales', Novembre 2012, Durée : 1 heure
.......... Corrections
brèves à la fin de l'épreuve
Question 1.
La verticilliose de la tomate est une maladie vasculaire causant des pertes énormes dans les cultures de la tomate (Lycopersicum esculentum ou Solanum lycopersicum). L'agent causal de la maladie est Vericilium dahliae.
Afin de trouver un marqueur moléculaire de la résistance
de la tomate à la verticilliose, Kawchuk et al. (1994,
Theor Appl Genet 89 ; 661-664) ont utilisé la technique RAPD
pour suivre la transmission (via des croisements) de marqueurs
moléculaires et de la résistance de deux plantes parentales
(de comportements différents) à leurs générations
'F1' et 'F2'. Le comportement des plantes vis-à-vis de la verticilliose
a été déterminé par infestation expérientale
en trempanat les racines dans une solution de spores de Vericilium
dahliae. La génération 'F1' s'est montrée
resistante à 100%. La génération 'F2' a montré
20 plants sensibles et 56 plants résistants à l'infection.
L'utilisation de l'amorce UBC458 (5'CTCACATGCC') dans l'amplification
de l'ADN par technique RAPD, suivie par électrophorèse
sur gel d'agarose 2%, a permis de révéler la présence
d'un fragement d'ADN de taille 1300 bp chez les plants de tomate sensibles
à la verticilliose et un autre fragment d'ADN de 1350 bp chez
les plants résistants de la génération 'F2' (voir
figure ci-dessous). En se basant sur les génotypes liés
au marquage de type 'RAPD', on peut classer les plants de tomate en
'plants résistants 1' (A, B), 'plants résistants 2'
(C, D) et 'plants sensibles' (E, F).
1) Rappeler le
mode de reproduction de la tomate. Peut-on parler de 'variété
fixée' ou 'variété hybride' (non fixée)
pour la tomate ?
2) Dans quelle stratégie
d'amélioration génétique des plantes rentrent
les activités du suivi de la ségrégation d'un
marqueur moléculaire et d'un trait agronomique précis,
suite à des croisements définis.
3) Quel(s) critère(s) moléculaire(s)
exploite la technique d'électrophorèse de l'ADN. S'il
s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal.
Justifier votre réponse
4) Le marquage moléculaire
de type 'RAPD' est basé sur la PCR (polymérisation en
chaîne de l'ADN). Rappeler les principales étapes d'un
protocole PCR.
5) Quelles sont les origines possibles
du polymorphisme de type 'RAPD' montré par la tomate en passant
d'un individu résistant à la verticilliose (exemple
D) à un individu sensible (exemple F).
6) Sur la base du marquage moléculaire
de type 'RAPD' obtenu par l'amorce UBC458, déterminer les génotypes
des 'plants résistants 1', 'plants résistants 2' et
'plants sensibles'.
7) Comment envisagez vous l'exploitation
du marquage de type 'RAPD' dans l'amélioration génétique
de la tomate pour la résistance à la verticilliose ?
Question 2.
A l'aide d'un tableau, comparer les marqueurs moléculaires de type 'RAPD' (apparus vers 1989) et les marqueurs de types RFLP (apparus vers 1980) en se limitant aux avantages et inconvénients principaux.
Corrections brèves
Réponse à
la Question 1: Rappeler le mode de reproduction de la tomate.
Peut-on parler de 'variété fixée' ou 'variété
hybride' (non fixée) pour la tomate ?
Le mode de reproduction de la tomate est l'autogamie (voir: QCM
sur systèmes de reproduction des plantes, Autogames
et allogames. Reproduction). Pour la tomate on parle de vriété
fixée car la fécondation se fait entre le pollen et
les ovules de la même fleur.
Réponse à la Question 2: Dans quelle stratégie
d'amélioration génétique des plantes rentrent
les activités du suivi de la ségrégation d'un
marqueur moléculaire et d'un trait agronomique précis,
suite à des croisements définis.
Lastratégie d'amélioration est la 'sélection assistée
par marqueurs' (MAS ou 'Marker Assisted Selection). Il faut au préalable
vérifier (à travers des croisements dirigés)
la liaison forte (linkage) entre le marqueur et le trait agronomique
précis (Vpoir: sélection
assistée par marqueurs).
Réponse
à la Question 3: Quel(s)
critère(s) moléculaire(s) exploite la technique d'électrophorèse
de l'ADN. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser
le principal. Justifier votre réponse.
L'éléctrophorèse
de l'ADN exploite les critères de la taille et de l'ionicité
(charge électrique). Cependant, la même charge (-) des
fragments de l'ADN (dues au phosphore) entraîne une séparation
sur le critère de la taille, uniquement. La forme des fragments
d'ADN résultant de la polymérisation par PCR n'intervient
pas dans la séparation.
Réponse
à la Question 4: Le
marquage moléculaire de type 'RAPD' est basé sur la
PCR (polymérisation en chaîne de l'ADN). Rappeler les
principales étapes d'un protocole PCR.
Les étapes principale d'une PCR sont 1/ Dénaturation
de l'ADN (température d'environ 94°C), 2/ Fixation
des amorces ('annealing', température d'environ 35°C-50°C),
3/ Elongation par la Taq DNA polymerase (polymérisation,
extension) réalisée à 72°C et 4/ Le
nombre de répétition du cycle (variable, 40-60).
Réponse à la Question 5: Quelles sont les origines possibles du polymorphisme de type 'RAPD' montré par la tomate en passant d'un individu résistant à la verticilliose (exemple D) à un individu sensible (exemple F). ;
Les origine du polymorphisme de type RAPD enregistré en passant des plants de tomate résistants à la verticilliose aux plants sensibles peuvent être:
1/ Mutation de type délétion entraînant l'apparition d'une région (< ou = 3000 pb) courte donnant un fragment d'ADN court après polymérisation par la Taq DNA polymerase (voir les marqueurs de type RAPD).
2/
Mutation ponctuelle aboutissant à l'apparition d'un nouveau
site de fixation de l'amorce derrière l'amplification de deux
segments d'ADN dont un segment très court, produisant un petit
fragment d'ADN qui sort rapidement du gel lors de l'électrophorèse
(artefact technique). Le deuxième segment donne un fragment
d'ADN de taille inférieure à celle du fragment d'ADN
n'ayant pas subit de mutation.
Réponse
à la Question 6: Sur la base du marquage moléculaire de type 'RAPD' obtenu par l'amorce
UBC458, déterminer les génotypes des 'plants résistants
1', 'plants résistants 2' et 'plants sensibles'.
Les 'plants résistants 1' sont des hétérozygotes
(Rs), les 'plants résistants 2' sont des homozygotes (RR) et
les 'plants sensibles' sont homozygotes différents (ss).
Réponse
à la Question 7: Comment envisagez vous l'exploitation du marquage de type 'RAPD' dans l'amélioration
génétique de la tomate pour la résistance à
la verticilliose ?
Le marquage RAPD obtenu avec l'amorce UBC458 (5'CTCACATGCC') peut être
exploité comme un marqueur précoce de la résistance
de la tomate à la verticilliose. On
n'aura pas recours à l'infestation expérimentale par
Vericilium dahliae. Il suffit de sélectionner les plantes
présentant un fragment d'ADN de taille 1350 pb.
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Réponse à la Question 2:
Comparaison des marqueurs moléculaires de type 'RAPD' et les marqueurs de types RFLP..
RAPD | RFLP | |
molécules du marquage | Fragment d'ADN résultant de l'amplification par PCR en présence d'une amorce | Fragment d'ADN provenant de la digestion de l'ADN par une enzyme de restriction suivie d'une hybridation par une sonde |
Nécessité d'ADN suffisamment pure | Non | Oui |
Caractère du marqueur | Dominant. Les individus hétérozygotes difficiles à distinguer des parents | Codominant. Les individus hétérozygotes se distinguent facilement des parents |
Temps de réalisation | Rapide | long |
utilisation de sondes marquées | Non | Oui |
VIDEOS
- Sélection Assistée
par Marqueurs (MAS)
- Autogames, allogames.
Exercice
- Sélection des
plantes autogames. Exercice
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détection d'hbrides interspécifique chez Cuphea
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génétique du bouleau, test Southern blotting (Contrôle S6)
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