RAPD, SSR. Pureté semences tomate Examen

Marqueurs de type RAPD et SSR dans le test de la pureté des semences de tomate

Matière 2. Marqueurs moléculaires en Biotechnologies et Amélioration des Plantes,
MODULE 'Biotechnologies et Amélioration des Plantes', Parcours S6 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Mai 2019, durée : 75 minutes.

L'hétérosis est bien prononcé chez la tomate. Il est exploité pour produire des graines de la génération F1 à traits agronomiques bien précis (calibre, fermeté, ..) et dont le prix s'élève à environ 10000 MAD pour 1 Kg. De ce fait, le test de la pureté des graines (semences) s'impose.

tomate

Afin de tester la pureté de graines commerciales provenant d'hybrides F1 de la tomate (Lycopersicon esculentum L.) correspondant au cultivar 'Hezuo 903', Liu et al (Sc. Hort. 2007, 115, 7-12) ont utilisé des marqueurs moléculaires de type RAPD et SSR, basés sur la PCR. L'ADN des feuilles de jeunes plants hybrides F1 et de leurs parents, a été purifié par la méthode CTAB. Pour le maquage RAPD, 218 amorces de 10 nucléotides ont été testées dans l'amplification de l'ADN faite suivant un programme constitué d'une dénaturation initiale à 94°C pendant 2 min, suivie par 40 cycles de 30 s à 94°C, 45 s à 37°C, 90 s à 72°C. Le programme est terminé par une élongation finale 10 min à 72°C et une conservation des amplifiats à 4°C. L'ADN produit par PCR a été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1,2%. La révélation est faite par EtBr. Les résultats ont montré que 13 amorces produisent des bandes spécifiques du parent femelle, F (amorces de type F), 10 amorces donnent des bandes spécifiques du parent mâle, M (amorces de type M). D'autres amorces donnent des bandes spécifiques des deux parents (amorces de type FM). Les résultats obtenus avec l'amorce NAURP1123 sont montrés dans la figure 1.

Pour le maquage SSR (microsatellites), 49 amorces synthétisées ont été testées dans l'amplification de l'ADN faite suivant un programme constitué d'une dénaturation initiale à 95°C pendant 2 min, suivie par 32 cycles de 40 s à 94°C, 45 s à 52-60°C, 60 s à 72°C.
Le programme est terminé par une élongation finale 7 min à 72°C et une conservation des amplifiats à 4°C. L'ADN produit par PCR a été analysé par électrophorèse à 120 V sur gel de polyacrylamide 8%. La révélation est faite par le nitrate d'argent. Les résultats obtenus avec l'amorce NAUSSRTO2 sont montrés dans la figure 2.

1) A quelle étape de la PCR correspondent les paramètres 45 s à 37°C et 45 s à 52-60°C pour les marquages RAPD et SSR, respectivement.
2) Pourquoi les auteurs utilisent dans la PCR une marge de température 52-60°C lors du marquage SSR ?.
3) Quelle(s) différence(s) structurale(s) de l'ADN derrière l'obtention de plusieurs bandes dans l'électrophorégramme représenté par la figure 2 ?
4) Quelle alternative au gel de polyacrylamide 8%, peut-on proposer pour séparer par électrophorèse les produits du marquage SSR ?
5) A l'aide d'un tableau, comparer les marqueurs de types RAPD et SSR (type de polymorphisme, déterminisme dominance-codominance, amorces, supports d'électrophorèse, méthode de révélation.
6) A Quel type d'amorce appartient l'amorce NAURP1123, utilisée dans le test RAPD de la pureté des semences. Justifier votre réponse
7) Lors du test RAPD de la pureté des semences F1, pourquoi les auteurs ont opté pour l'utilisation de l'amorce NAURP1123?.
8) A l'aide d'un tableau et en se référant aux figures 1 et 2, analyser les résultats des tests de pureté des semences par les marqueurs RAPD et SSR (taille approximative en pb des bandes spécifiques du parent F, bandes spécifiques du parent mâle, nombre d'homozygotes, nombre d'hétérozygotes).
9) Déterminer en %, la pureté des graines de tomate, comme révélée par les marqueurs RAPD et SSR.
10) Si le prix des semences sans impureté est 10000 MAD le Kg, quel sera le prix des semences du cultivar hybride F1 'Hezuo 903' ?
11) Si vous optez pour la création d'une entreprise de production et certification de semences, quels seront vos prérecquis ?

REPONSES. DETAILS

Réponse Q1. " Etape de la PCR correspondant aux températures 45 s à 37°C et 45 s à 52-60°C pour les marquages RAPD et SSR, respectivement : Etape de la Fixation des amorces (annealing)
Réponse Q2. Les auteurs utilisent dans la PCR une marge de température 52-60°C lors du marquage SSR, car les marqueurs SSR utilisent deux amorces différentes et la température de fixation varie selon la nature des amorces. Par contre RAPD utilise une seule amorce (de 10 nucléotides)
Réponse Q3." Différence(s) structurale(s) de l'ADN derrière l'obtention de plusieurs bandes dans l'électrophorégramme représenté par la figure 2, est le nombre de répétition d'une séquence d'ADN.
Réponse Q4. Comme alternative au gel de polyacrylamide 8%, peut-on proposer pour séparer par électrophorèse les produits du marquage SSR, un gel d'agarose très concentré (exemple 3%)
Réponse Q5.Comparaison des marqueurs de types RAPD et SSR

tomate RAPD, SSM

Réponse Q6.
" L'amorce NAURP1123, utilisée dans le test RAPD de la pureté des semences appartient au type FM. Elle donne une bande spécifique du parent mâle et une autre spécifique du parent femelle. Elle est convenable pour la détection hybrides montrant les bandes spécifiques de deux parents,
Réponse Q7. Lors du test RAPD de la pureté des semences F1, les auteurs ont opté pour l'utilisation de l'amorce NAURP1123 pour éviter le caractère de dominance montré par les marqueurs de type RAPD (polymorphisme de type absence-présence). En effect cette amorce permet d'amplifier la bande spécifique du parent mâle et celle du parent femelle.

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Réponse Q8.Analyser les résultats des tests de pureté des semences par les marqueurs RAPD et SSR (figures 1 et 2), (taille approximative en pb des bandes spécifiques du parent F, bandes spécifiques du parent mâle, nombre d'homozygotes, nombre d'hétérozygotes).
RAPD SSR

rapd, ssr semences tomate

Réponse Q9. Pureté des graines de tomate, comme révélée par les marqueurs RAPD et SSR est 85% (soit 17 hétérozygotes/20 graines).
Réponse Q10.Si le prix des semences sans impureté est 10000 MAD le Kg, le prix des semences du cultivar hybride F1 'Hezuo 903' 8500 MAD
Réponse Q11. Pour la création d'une entreprise de production et certification de semences, les prérecquis principaux sont :
- champs pour la pratique de l'hybridation
- Laboratoire pour le développement des marqueurs
- Compétences suffisantes sur les marqueurs moléculaires 9P5ZJRDsYbU

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