Marqueurs RFLP, RAPD, Examen (Cyprès)

Marqueurs RFLP, RAPD et sélection assistée par marqueurs (MAS) chez le Cyprès. Examen

Les marqueurs moléculaires RFLP (restriction de l'ADN) et RAPD (basé sur la PCR) peuvent être utilisés pour établir les cartes génétiques (ici cas du Cyprès du Japon). Ceci permet la sélection assistée par marqueurs.
Examen de l'élément de module 'Génétique et Amélioration des plantes'' (partie 'marquage moléculaire et amélioration des plantes'), module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Janvier 2013", Durée : 1 heure .......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve

Le cyprès du Japon (Cryptomeria japonica) est une conifère appartenant à la famille des cyprès (Cupressacées) originaire d'Extrême-Orient. L'espèce est présente au Japon, en Chine, en Corée et l'île de la Réunion.

Cyprès. Marqueurs RFLP, RAPD

Afin de réaliser la cartographie génétique de cette plante précisant l'emplacement sur les chromosomes de caractères morphologiques et de marqueurs moléculaires, Mukai et al., 1995 (Theor. Appl. Genet. 90, 835-840) ont étudié la ségrégation du caractère morphologique 'plante naine' et des marqueurs de types RFLP et RAPD sur la population F2.
L'ADN a été purifié à partir de 73 plantes d'une génération F2, d'une plante de la génération F1 et des parents male et femelle correspondants (P1 et P2). Pour obtenir des marqueurs moléculaires de type RFLP, l'ADN des extraits a subit une digestion par l'enzyme de restriction Hind III suivie d'une électrophorèse sur gel d'agarose 0,7% et une révélation par une sonde marquée. D'autre part, les extraits d'ADN des mêmes plantes ont été amplifiés de façon aléatoire à l'aide d'amorces de 10 nucléotides (technique RAPD). Les fragments d'ADN amplifiés ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les électrophorégrammes relatifs aux marquage RFLP et RAPD sont représentés par les figures 1 et 2, respectivement (les marqueurs M indiquent les tailles en kbp des fragments d'ADN séparés.

L'étude de ségrégation des marqueurs moléculaires de types RFLP (préfixes GD et CD) et RAPD (lettre unique en majuscule), ainsi que le caractère morphologique 'plante naine' (MT-d), a permis d'obtenir 13 groupes de liaison couvrant une carte génétique de 887,3 cM. La figure 3 montre le groupe de liaison N° 2 associant plusieurs marqueurs de types différents.
1) Rappeler le(s) critère(s) moléculaire(s) exploité(s) dans la séparation de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal. Justifier votre réponse.
2) Rappeler les origines du polymorphisme de type RFLP.
3) Le marquage moléculaire de type 'RAPD' est basé sur la PCR (polymérisation en chaîne de l'ADN). Rappeler les principales étapes d'un protocole PCR.
4) Quelles sont les origines d'un polymorphisme de type RAPD ?
5) A l'aide d'un tableau, comparer les marqueurs moléculaires de tpe RFLP et RAPD (nature des extraits d'ADN, étapes principales, enzymes utilisées, effet de l'environnement, reproductibilité, déterminisme de dominance-codominance).
6) En s'aidant des figures 1 et 2, comparer les génotypes à base des marqueurs RFLP et RAPD trouvés chez la population F2 du cyprès du Japon et des parents P1 et P2 et F1 (nature homozygote, hétérozygote).
7) Rappeler le principe sur lequel est basée la cartographie génétique et l'établissement de distances exprimées en cM.
8) Dans quelle stratégie d'amélioration génétique des plantes peut être utile la cartographie génétique ? En préciser les avantages et les limites.
9) A l'aide de la figure 3, préciser les marqueurs moléculaires susceptibles d'être utilisés pour renseigner sur le caractère morphologique 'plante naine' chez le cyprès du Japon. Justifier votre réponse.

Corrections brèves

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Réponse à la Question 1: Critère(s) moléculaire(s) exploité(s) dans la séparation de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal. Justifier votre réponse
La séparation par électrophorèse des fragments d'ADN résultant de la restriction (technique RFLP) l'ADN exploite les critères de la taille et de l'ionicité (charge électrique). Cependant, Il n'y a pas de différences de charges électriques (charges - dues au phosphore) entre es fragments de l'ADN. Ceci entraîne une séparation sur le critère de la taille, uniquement. La forme des fragments d'ADN résultant de la digestion de l'ADN n'intervient pas dans la séparation. Lien utile : Marqueurs RFLP

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Réponse à la Question 2: Les origines du polymorphisme de type RFLP
- Perte ou gain d'un site de restriction (illustration à l'aide d'un dessin)
- Mutation de type insertion-déletion (illustration à l'aide d'un dessin). Lien utile : Marqueurs RFLP
Réponse à la Question 3: Principales étapes d'un protocole PCR:
- Dénaturation de l'ADN à une température élevée de l'ordre de 94°C pendant un temps d'environ 2-4 minutes. Ceci permet de séparer les deux brins de l'ADN.
- Fixation des amorces à une température d'environ 35°C pendant 30-60 secondes.
- Elongation (ou polymérisation) à une température d'environ 72°C pendant 1 minutes. L'enzyme Taq DNA polymérase joue un rôle capital dans cette étape. Des fragments d'ADN complémentaires aux nucléotides de la matrice sont ainsi synthétisés.
--> répétition des 3 étapes entre 40-60 fois, environ. Lien utile: Marqueurs RAPD
Réponse à la Question 4: Origines d'un polymorphisme de type RAPD
- Disparition par mutation (mutation ponctuelle, crossing-over, insertion, délétion,.) d'un ou plusieurs sites de fixation de l'amorce.
- Eloignement, par insertion, des sites de fixation de l'amorce à une distance supérieure à 3000 pb. Il en résulte la disparition de fragments de DNA.
- Rapprochement, par délétion, des sites de fixation de l'amorce à une distance inférieure ou égale à 3000 pb. Il en résulte l'apparition de fragments surnuméraires.
- Rapprochement très accusé des sites de fixation de l'amorce ne donnant lieu qu'à de petits fragments de DNA n'apparaissant pas sur le gel après électrophorèse.
Lien utile: Marqueurs RAPD
Réponse à la Question 5: Comparaison des marqueurs moléculaires de tpe RFLP et RAPD (nature des extraits d'ADN, étapes principales, enzymes utilisées, effet de l'environnement, reproductibilité, déterminisme de dominance-codominance).

	RFLP	RAPD
Nature des extraits de l'ADN	ADN hautement purifié	ADN partiellement purifié
Etapes principales	Digestion de l'ADN, électro-phorèse, transfert des fragments d'ADN sur membrane de nitro-cellulose, révélation avec une sonde marquée	Amplification de l'ADN à l'aide d'amorces en présence de Taq DNA polymérase, électro-phorèse, révélation par une méthode appropriée comme celle utilisant le bromure d'éthidium.
Molécules du marquage	Fragment d'ADN provenant de la digestion de l'ADN par une enzyme de restriction suivie d'une hybridation par une sonde marquée	Fragment d'ADN résultant de l'amplification par PCR en présence d'une amorce
Enzymes utilisées	Enzyme de restriction de l'ADN	Taq DNA polymérase
Effet de l'environnement	Non	Non
Reproductibilité	Elevée	Moyenne
Caractère du marqueur (déterminisme)	Co-dominant. Les individus hétéro-zygotes se distinguent facilement des parents	Dominant. Les individus hétéro-zygotes difficiles à distinguer des parents
Temps de réalisation	long	Rapide
Utilisation de sondes marquées	Oui	Non

Réponse à la Question 6: Comparaison des génotypes à base des marqueurs RFLP et RAPD trouvés chez la population F2 du cyprès du Japon et des parents P1 et P2 et F1 (nature homozygote, hétérozygote, figures 1 et 2).
RFLP:P1: hétérozygote (2 bandes), P2: homozygote (une bande), F1: hétérozygote (2 bandes), F2: plus de 50% d'hétérozygotes. Les hétérozygotes sont faciles à distinguer des parents
RAPD: Le polymorphisme est limité aux deux bandes dont la migration est indiquée par une flèche. P1: homozygote (1 bande en haut), P2: homozygote (une bande une bande en bas), F1: hétérozygote (2 bandes), F2: environ de 75% d'hétérozygotes. Les hétérozygotes restent difficiles à distinguer des parents

Réponse à la Question 7: Principe sur lequel est basée la cartographie génétique et l'établissement de distances exprimées en cM
La cartographie génétique est basée sur l'observation de la transmission des caractères héréditaires (fréquence des recombinaisons des gènes). Les distances génétiques sont le reflet de la fréquence de recombinaison. Pendant la méïose, les 'crossing-over' provoquent l'échange de matériel génétique entre chromosomes homologues. Plus deux gènes (deux marqueurs) sont proches, moins ils ont de chances d'être séparés par un crossing-over et plus la distance génétique entre eux sera petite. Lorsque deux marqueurs sont suffisamment proches pour n'être séparés qu'une fois sur 100, on fixe la distance génétique qui les sépare à 1 centimorgan (1 cM). Il s'agit d'une mesure équivalente à 1% de recombinaison (1% de crossing-over ou 1 crossing-over pour 100 méioses).
Si deux marqueurs ne sont pas 'liés' (s'ils sont situés sur deux chromosomes différents) ils seront séparés (en moyenne) une fois sur deux. La fréquence de recombinaison maximale est donc de 50% (0,5).

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Réponses (suite)

Réponse à la Question 8: Stratégie d'amélioration génétique des plantes où peut la cartographie génétique peut être utile. En préciser les avantages et les limites.
La cartographie génétique peut être utile dans la séléction assistée par marqueurs (MAS, Marker Assisted Selection), comme stratégie d'amélioration des plantes. La MAS est basée sur la possibilité de détecter la présence d'un gène ou d'un trait agronomique intéressant par la recherche du marqueur qui lui est étroitement lié (linkage) avec une distance génétique faible.
Les avantages principales de la MAS sont:
- La MAS est non destructive
- La MAS nécessite peu de tissu végétal
- La MAS n'est pas influencée par des facteurs environnementaux.
Parmi les inconvénients de la MAS, on note l'inefficacité dans la sélection de caractères agronomiques à déterminisme génétique complexe (comme le rendement, par exemple), gouvernés par un grand nombre de gènes ou de QTL qui interagissent et dont la plupart sont encore inconnus.
Lien utile: Sélection assistée par marqueurs (MAS)
Réponse à la Question 9: Les marqueurs moléculaires susceptibles d'être utilisés pour renseigner sur le caractère morphologique 'plante naine' chez le cyprès du Japon (figure 3).
Les marqueurs pouvant être utilisés dans la prédiction du caractère 'plante naine' sont: 1/ le marqueur K06b de type RAPD, distant du trait 'plante naine' (MT-d) par une distance de 8,1 cM, 2/ les marqueurs GD3206 et CD1942, tous de type RFLP et situés à de faibles distances de MT-d.