TRANSFORMATION GENETIQUE DE LA BETTERAVE SUCRIERE PAR TRANSGENESE POUR L'EXPRESSION D'UN INHIBITEUR DE LA POLYGALACTURONASE D'UN CHAMPIGNON (Colletotrichum lindemuthianum).

betterave sucrière


TRANSFORMATION GENETIQUE DE LA BETTERAVE SUCRIERE PAR TRANSGENESE POUR L'EXPRESSION D'UN INHIBITEUR DE LA POLYGALACTURONASE D'UN CHAMPIGNON (Colletotrichum lindemuthianum).


Contrôle de la matière 'Marqueurs moléculaires et Amélioration des plantes' du module 'Biotechnologies et amélioration des plantes', Master 'Gestion et valorisation des phytoressources', S3, Janvier 2017, Faculté Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Morocco. Durée : 60 minutes
Cet examen porte sur la transformation de la betterave sucrière par transgénèse visant l'introduction du gène d'un inhibiteur de la polygalacturonase rendant les plantes résistantes aux chmpignons.
.......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve

Pour se protéger contre les polygalacturonases des champignons, microbes et insectes, les plantes produisent des inhibiteurs de polygalacturonases (PGIPs) qui sont des protéines associées à leurs parois. Un seul inhibieur PGIP est capable de reconnaître une gamme large de polygalacturonases. Il permet de prévenir la dégradation de la paroi des plantes. Afin de limiter les dégâts causés par le champignon Colletotrichum lindemuthianum sur la betterave sucrière, Mohammadzadeh et al. (Turk J Agr For 39, 2015) ont tenté de créer des plantes transgéniques porteuse du gène Pgip 1 de Phaseolus vulgaris (Pvpgip 1) codant pour un inhibiteur de polygalacturonase bien connu. La figure 1 montre la construction génique utilisé par les chercheurs

t-dna

Fig. 1

Deux variétés de betterave sucrière (SBSI-01 et SBSI-02) ont subi la transformation par co-culture avec Agrobacterium tumefaciens (transfert binaire). Les plantes sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (20%-13,9%), ont été testées par PCR pour la présence du transgène Pvpgip 1. Ainsi, l'ADN a été extrait des feuilles en utilisant la méthode au CTAB (Dellaporta et al., 1983). Son amplification a été réalisée par une paire d'amorces spécifique du transgène et génératrice d'un fragment d'ADN de 1029 bp.
Pour les analyses de type 'southern', des quantités 25 µg d'ADN génomique on été hydrolysées séparément par EcoR1 et EcoR1/HindIII. L'électrophorèse a été réalisée sur gel d'agarose à 0,8%. La figure 2 résume les résultats obtenus. Deux variétés de betterave sucrière (SBSI-01 et SBSI-02) ont subi la transformation par co-culture avec Agrobacterium tumefaciens (transfert binaire). Les plantes sélectionnées pour leur résistance à la kanamycine (20%-13,9%), ont été testées par PCR pour la présence du transgène Pvpgip 1. Ainsi, l'ADN a été extrait des feuilles en utilisant la méthode au CTAB (Dellaporta et al., 1983). Son amplification a été réalisée par une paire d'amorces spécifique du transgène et génératrice d'un fragment d'ADN de 1029 bp.
Pour les analyses de type 'southern', des quantités 25 µg d'ADN génomique on été hydrolysées séparément par EcoR1 et EcoR1/HindIII.

L'électrophorèse a été réalisée sur gel d'agarose à 0,8%. La figure 2 résume les résultats obtenus.
inhibiteur de la plygalacturonase

D'autre part, pour tester l'effet inhibiteur des extraits de feuilles sur l'activité enzymatique de Colletotrichum lindemuthianum, un filtrat fongique a été préparé par culture du mycélium du champignon dans un milieu nutritif contenant 1% de la pectine de pomme. Les extraits de protéines susceptibles de contenir le produit d'expression du transgène, ont été préparés par homogénéisation des feuilles dans un tampon approprié suivie d'une centrifugation. Des volumes de surnageant (extrait brut) correspondant à 30 µg de protéines, ont été utilisés dans les tests d'inhibition des endo-polygalacturonases produites par Colletotricum Lindemuthianum. L'effet inhibiteur des extraits de plantes a été évalué par méthode de diffusion sur agarose où les filtrats du champignon et/ou les extraits de plantes ont étés déposés dans des puits ménagés sur des plaques d'agarose 0,8% contenant un tampon acétate 0,1 M (pH 4,6) et 0,5% de pectine de Citrus. Après incubation 16 heures à 27°C, la plage d'inhibition a été visualisée par traitement avec HCl 6 N pendant 1 minute. L'inhibition a été exprimée en %. Les résultats des tests d'inhibition obtenus dans le cas de la transformation des deux variétés de betterave sucrière, sont montrés dans la figure 3.

transgénèse

1. Rappeler Le principe de transformation génétique des plantes par Agrobacterium tumefaciens comme vecteur (système binaire).
2. En se référant aux résultats relatifs aux analyses des plantes transformées (Fig. 2), spécifier le rôle de l'expérience consistant à hydrolyser l'ADN des plantes par le couple d'enzymes EcoR1/HindIII. Justifier votre réponse.
3. Spécifier le rôle de l'expérience consistant à hydrolyser l'ADN des plantes par l'enzyme EcoR1. Justifier votre réponse.
4. Pour chacune des trois plantes représentant chaque cultivar de betterave sucrière (Fig. 2), spécifier (dans un tableau) le nombre de copies du transgène intégrées dans les nouvelles plantes.
5. En analysant les figures 2 et 3, pouvez vous établir une relation entre le nombre de copies du transgène intégrés dans les plantes, le type de cultivars et le pouvoir inhibiteur des extraits végétaux vis à vis des endo-polygalacturonases de Colletotricum Lindemuthianum ?
6. Quelles seraient les autres méthodes de détection du produit de l'expression (traduction) du transgène dans les nouvelles plantes de la betterave sucrière ? En expliquer le principe.
7. Malgré leur incorporation du transgène, certaines plantes régénérées comme le plant T0-022', n'avaient montré qu'un effet inhibiteur limité contre la polygalacturonase du champignon. Donner des explications possibles pour ce résultat.
8. Rappeler d'autre(s) méthode(s) de transformation génétique visant l'inhibition de la polygalacturonase chez les plantes. En expliquer le principe.


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REPONSES BREVES


Réponse à la Question 1: Principe de transformation génétique des plantes par Agrobacterium tumefaciens comme vecteur (système binaire).
La transformation génétique des plante par le vecteur Agrobacterium tumefaciens selon le système binaire consiste à utiliser un Agrobactrium recombinant contenant deux plasmides dont le plasmide de virulence (désarmé et apportant les gènes de virulence) et un plasmide binaire construit dans E.Coli et contenant contenant le gène d'intérêt). Un troisième plasmide dit 'plasmide helper', est également utilisé pour améliorer le transfert du plasmide binaire d'E. coli vers A. tumefaciens grâce à ses gènes tra (pour transfer) et mob (pour mobilization) codant pour les protéines tra et mob. L'Agrobacterium recombinant est issu d'une conjugaison triparentale.
Lien utile : Transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens.
Réponse à la Question 2: en se référant aux résultats relatifs aux analyses des plantes transformées (Fig. 2), le rôle de l'expérience consistant à hydrolyser l'ADN des plantes par le couple d'enzymes EcoR1/HindIII est la démonstration de présence du transgène, sans donner une idée sur le nombre de copies intégrées. En effet, la figure 1 montre que les sites de restrictions EcoR1 et HindIII cadrent bien le transgène avec le promoteur et le terminateur.
Réponse à la Question 3: le rôle de l'expérience consistant à hydrolyser l'ADN des plantes par l'enzyme EcoR1. est de déterminer le nombre de copies du transgène intégrées dans l'ADN des plantes. En effet, l'enzyme EcoR1 coupe à l'extérieur du transgène et la sonde ne couvre pas le site de restriction. Dans ce cas Une seule copie du transgène est renseignée par un fragment d'ADN (bande) de taille indéterminée.
Réponse à la Question 4: Pour chacune des trois plantes représentant chaque cultivar de betterave sucrière (Fig. 2), spécifier (dans un tableau) le nombre de copies du transgène intégrées dans les nouvelles plantes.
Cultivar Plante Copies Inhibition

Cultivar Plantes Nombre de copies Inhibition
SBSI-1 017' 2 Elevée
083 1 Elevée
114' 2 Elevée
SBSI-2 22' 1 faible
130 2 Elevée
063 3 Elevée

Lien: Nombre de copies du transgène intégré

Réponse à la Question 5: En analysant les figures 2 et 3, il n'existe pas de relation précise entre le nombre de copies du transgène intégrés dans les plantes, le type de cultivars et le pouvoir inhibiteur des extraits végétaux vis à vis des endo-polygalacturonases de Colletotricum Lindemuthianum . En effet les plantes 083 et 22' ayant le même nombre de copies du transgène, présentent des pouvoirs d'inhibition différents.
Réponse à la Question 6: D'autres méthodes de détection du produit de l'expression (traduction) du transgène dans les nouvelles plantes de la betterave sucrière peuvent être proposées dont :
1/ Test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). C'est une une méthode visuelle de détection de la présence de la protéine. Pour cela, des extraits de protéines sont préparés à partir des tissus des plantes transformées. Ces protéines établissent une liaison spécifique avec un anticorps anti-protéine cible préalablement fixé sur les des puits d'une plaque ELISA. Un deuxième anticorps spécifique de la protéine, couplé à une enzyme (comme la peroxydase), est ajouté dans le milieu. Si la protéine correspondante au transgène est présente, il se forme un complexe anticorps-protéine-anticorps.
2/ Test dot-blot d'immunodetection
3/ Test 'Western blotting' et immunodétection. Il se fait après électrophorèse des extraits protéiques.
Réponse à la Question 7:Malgré leur incorporation du transgène, certaines plantes régénérées comme le plant T0-022', n'avaient montré qu'un effet inhibiteur limité contre la polygalacturonase du champignon. Parmi les explications possibles pour ce résultat, on cite :
1/ Phénomène de 'silencing' épigénétique de l'expression du gène par des séquences répétées de DNA.
2/ Co-suppression par interférence de brins d'ARN.
3/ DNA méthylation.
4/ Instabilité du mRNA.
Réponse à la Question 8: Une des méthodes de transformation génétique visant l'expression de l'inhibition de la polygalacturonase chez les plantes, est la transformation par ARN d'interférence (RNAi, interférence ARN, ARN bicaténaire. L'ARN antisens est un ARN simple brin complémentaire à un brin d'ARN messager qui sera détruit. Lien: Transformation par ARN antisens . Aussi, La Transformation par ARN d'interférence (RNAi) permet de diminuer production d'une famille de molécules. L'ARNi (interférence ARN, ARN bicaténaire), peut bloquer la transcription et la traduction. L'interférence de l'ARNi avec un ARN messager spécifique conduit à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine.


LIENS UTILES:


- Recherches scientifiques au Maroc sur Betterave sucrière
- Gène. Structure
- Génie génétique. Cours
- Biologie moléculaire et génie génétique. Liens
- Génie génétique. QCM de base (FR, Ar)
- Clonage des gènes. QCM
- Chitinase. Transformation génétiques (contrôle)
- Microsatellites (SSR) et transgénèse chez le niébé. Examen S6 2017
- Transformation du bouleau avec la toxine BGT (contrôle)


ENSEIGNEMENT DE MASTER


- - - Cours du Master Biotechnologies et Amélioration des Plantes, Marrakech
- Travaux pratiques Master Biotechnologies et Amélioration des Plantes, Marrakech


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    Transgénèse. Caractérisation transformants, évaluation