Tomate. Transformation par Agrobacterium تحوير الطماطم

Transformation de la tomate par Agrobacterium tumefaciens
تحوير جيني للطماطم

Contrôle de la matière 2 du module 'Biotechnologies et amélioration des plantes', partie transgénèse, parcours 'Biologie appliquée aux productions végétales', S6, Juin 2022l, Faculté Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Morocco. Durée : 60 minutes
Corrections brèves à la fin de l'épreuve ---- Liens à contenu similaire

tomate

Afin d’améliorer la technique de transfert de transgènes par Agrobacterium tumefaciens en utilisant la culture des tissus de la tomate, Dulam Sandhya et al., 2022 ont utilisé la souche Agrobacterium LBA4404 avec le plasmide pCAMBIA1305.1 contenant les gènes hptII (Hygromycin Phosphotransferase) et gusA (béta-glucuronidase) utilisés pour l'évaluation de l’efficacité de transformation dans des conditios précises. Les explants de cotylédons, d'hypocotyles et de feuilles des deux cultivars de tomate (Arka Vikas et PED), ont été infectés par une suspension d'Agrobacterium en agitant à intervalles réguliers. Des explants non infectés ont constitué des témoins.
L'ADN génomique a été purifié à partir des feuilles de plants de tomate expérimentaux et témoins par la méthode au CTAB. Il a été amplifié par PCR à l’aide d’amorces spécifiques de hptII (hptII FP : 5’-TAGCGAGAGCCTGACCTATT-3’ ; hptII RP : 5’-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3’) et gusA (gus FP : 5’- CCATCGAAGTACCATCCGTTATAG-3’ ; gus RP : 5’-GAAGAGGGCCTCGGAAAAGT-3’) pour vérifier présence des gènes hptII et gusA dans les transformants de tomate. La dénaturation de l'ADN génomique a été réalisée pendant 5 min à 95°C, suivi de 30 cycles de dénaturation à 95°C pendant 30 sec, fixation d’amorces à 55°C (hptII et gusA) pendant 1 min et élongation à 72°C pendant 2 min. La réaction finale a été achevée à 72°C pendant 10 min. Les produits amplifiés ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%. Les test ‘southern blotting’ ont été réalisés en exposant 10 µg d’ADN à une digestion par EcoRI pendant 2 heures. Les fragments d’ADN ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% (p/v). Après transfert sur membrane de nylon, l’ADN a été hybridé pendant une nuit à 42°C, avec une sonde spécifique du gène hptII, marquée par la digoxygénine. Les figure 1a, 1b et 1c donnent un exemple des résultats des tests moléculaires des essais de transformation du cultivar Arka Viska.
[*L'efficacité de la transformation génétique des deux variétés de tomate a été testée en fonction de plusieurs paramètres dont l'effet du type d'explant, l'effet de la densité bactérienne (DO à 600 nm) ayant servie pour la transformation et l'effet de la durée de l'infection bactérienne. Les auteurs ont conclu que les protocoles de cultures et d’infection ont permis d’obtenir des efficacités de transformation de 42.8% pour le cultivar PED et 64.6% pour le cultivar Arka Vikas. Les résultats obtenus sont donnés dans les figure 2a et 2b.
Références: Sandhy, D., Jogam, P., Ajay Kumar Venkatapuram, Savitikadi, P., Peddaboina, V., Venkateswar Rao Allini, Abbagani, S. 2022. Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation and plant regeneration system for genome engineering in tomato. Saudi Journal of Biological Sciences 29 (2022) 103292

Questions de type QCM

QUESTION 1. Transgenèse. note/1. La création d'une variété nouvelle par transgénèse (choisir l'information juste):(!rapide, matériellement chère)(!utilise la reproduction sexuée dans le transfert)(!s'apparente à une hybridation)(donne des individus de même génotype)(!n'utilise pas souvent l'ADN recombiné)(!s'apparente à une mutation)

QUESTION 2. Transgenèse. note/1. Etapes de la transgenèse: (choisir la réponse fausse):(!sélection d'un gène chez un donneur)(suppression du matériel génétique du receveur)(!croisements dirigés pour vérifier la transmission du transgène)(!sélection d'individus intégrant le transgène)

QUESTION 3. Transgenèse. note/1. Méthode de transfert des transgènes non convenable pour les monocotylédones: (choisir l'information juste):(!biolistique)(!électroporation)(Agrobacterium tumefaciens)(!PEG)

QUESTION 4. Transgénèse. gènes de sélection et gènes rapporteurs. note/1. Choisir au plus DEUX informations fausses:(!Le gène hptII codant pour une phosphotransférase inactivant l'hgromycine est un marqueur de sélection.)(!Le gène GusA codant pour une glucuronidase générant un produit coloré par action sur un substrat est un gène rapporteur.)(Par histochimie, le gène GusA génère une couleur verte.)(Le gène rapporteur gfp exige la fixation des tissus et nécessite un substrat chromogène)(!Le gène LacZ codant pour la béta galactosidase requiert la fixation des tissus et nécessite un substrat chromogène.)

QUESTION 5. Purification de l'ADN et électrophorèse. note/1. Choisir l'information fausse:(un ADN bien purifié est un ADN non altéré avec un rapport DO260/DO280 compris entre 1 et 1,6)(!Le CTAB est un détergent rompant les structures lipidiques.)(!Les sels et le pH élevé permettent de rompre les liaisons ADN-protéines.)(!Par rapport aux eucaryotes, l'ADN des procaryotes et plus facile à purifier)(!L'ARN reste un contaminant de l'ADN)

QUESTION 6. Electrophorèse de l'ADN. note/1. Choisir l'information fausse:(!Le dépôt de l'ADN se fait à la cathode)(!Le gel d'agarose 3% est convenable pour séparer l'ADN de faible taille)(Le gel de polyacrylamide 6% est convenable pour séparer l'ADN de taille élevée)(!Le gel d'agarose 1% est convenable pour séparer l'ADN de taille moyenne)(!Le BET révèle l'ADN et l'ARN)

QUESTION 7. Trangénèse. Techniques de caractérisation moléculaires et biochimiques note/1. L'intégration d'un transgène dans une plante hôte peut être testée par PCR, avec: (choisir au plus DEUX informations fausses)(ADN traité par endonucléases.)(!Deux amorces.)(!Taq polymérase)(Electrophorèse sur gel de polyacrylamide et southern blotting)(!Elongation à 72°C)(!Gel d'agarose révélé par BET)

QUESTION 8. Trangénèse. Techniques de caractérisation moléculaires et biochimiques. note/1. L'intégration d'un transgène dans une plante hôte peut être testée par: (choisir au plus DEUX informations fausses)(!Technique dot-blot d'ADN)(!Technique RFLP et hybridation)(Technique dot-blot d'immunodétection)(!PCR avec amorces du transgène.)(Northern blotting.)

QUESTION 9. Trangénèse. Interprétation des résultats note/1,5. La figure 1a informe sur: (choisir au plus DEUX informations fausses).(Le nombre de copies du transgène intégré dans les plants L4 et L5 est supérieur à celui des autres plantes.)(!Les amorces du gène nptII ont pu se fixer sur l'ADN des plants transformés.)(!Les amorces du du gène nptII ne se sont pas fixées sur l'ADN du plant WT.)(!Le gène nptII s'est bien intégré dans l'ADN du cultivar Arka Vikas.)(Intégration du gène nptII en une seule copie chez les plants L1 à L5)

QUESTION 10. Trangénèse. Interprétation des résultats note/1,5. La figure 1b informe sur: (choisir au plus DEUX informations fausses).(!le gène gusA s'est bien intégré dans l'ADN du cultivar Arka Vikas.)(Intégration du gène gusA en une seule copie chez les plants L1 à L5.)(!Les amorces du gène gusA ne se sont pas fixées sur l'ADN du plant WT.)(!les amorces du gène gusA se sont fixées sur l'ADN des plantes transformées.)(Le nombre de copies de transgène intégré dans les plants L4 et L5 est supérieur à celui des autres plantes.)(!le profile NT montre l'absence de contamination de l'ADN des plants.)

QUESTION 11. Trangénèse. Interprétation des résultats note/1,5. La figure 1c informe sur: (choisir au plus DEUX informations fausses).(Le gène hptII s'est bien transcrit chez les plants L1 à L4 du cultivar Arka Vikas.)(!Intégration du gène hptII en une à trois copie chez les plants L1 à L4.)(!l'objectif de cette expérience peut être atteint par coupure de l'ADN du transgène sur ses 2 extrémités et mesure de l'intensité des bandes)(La sonde correspondant au gène hptII se fixe sur les deux extrémités des fragments d'ADN.)(!La plante L3 peux ou ne peux exprimer la protéine hptII.)

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QUESTIONS OUVERTES

Interpréter brièvement l'efficacité de la transformation génétique de la tomate par Agrobacterium tumefaciens, eu égard aux paramètres de culture de la tomate (fig. 2). Note/2,5, (utiliser une feuille à part).
1. Montrer l'effet de l'explant.
2. Montrer l'effet de la durée de l'infection.
3. Quels peuvent être les facteurs importants dans l'infection des plantes par Agrobacterium tumefaciens
4. Proposez d'autres méthodes de transfert du transgène.

REPONSES. DETAILS

Réponses à la question 4: Par histochimie, le gène GusA génère une couleur bleue (et non verte, à ne pas confondre avec GFP)
gene rapporteur
Contrairement au gène Gus, le gène rapporteur gfp n'exige pas la fixation des tissus et ne nécessite pas un substrat chromogène. Il suffit d'exposer le tissu ou organe à une radiation bleue ou UV pour voir une couleur verte. Lien: Gènes de selection et Gènes rapporteurs en transgénèse
Réponses à la question 5: un ADN bien purifié est un ADN non altéré avec un rapport DO260/DO280 compris entre 1,8 et 2. Lien: ADN purifié.
Réponses à la question 7: L'intégration d'un transgène dans une plante hôte peut être testée par PCR, avec: ADN NON traité par endonucléases, Electrophorèse sur gel d'agarose et révélation par BET (sans southern blotting!)
Réponses à la question 10: la première PCR (simple) ne peut pas rendre compte du nombre de copies du transgène intégrées, car elle consiste en une simple amplification (تكثيف المورث) du transgène à l'aide de ses amorces suivie d'une révélation par BET. Ceci permet uniquement vérifier sa présence ou absence. La connaissance du nombre de copie s'effectue souvent par southern blotting (digestion de l'ADN par une enzyme de restriction; transfert et hybridation avec une sonde. Liens: Page PCR d'intégration du transgène -- Section de vidéo sur PCR d'intégration du transgène.
Réponses à la question 11: la formulation 'Le gène hptII s'est bien transcrit chez les plants L1 à L4 du cultivar Arka Vikas' est fausse, car cette espérience ne peut juger sur la transcription de l'ADN en ARN. Nous somme uniquement dans un southern blotting et pas northern blotting
La sonde correspondant au gène hptII doit se fixe sur une seule extrêmité des fragments d'ADN au lieu de deux extrémités. Voir explication sur la vidéo:
Réponses aux Questions ouvertes :
1 Effet du type d'explant sur l'efficacité de la transformation de la tomate par Agrobacterium tumefaciens: le type d'explant influence fortement l'efficacité de la transformation. Celle ci est plus élevée avec les cotylédons, moyenne avec les hypocotyles et faible avec les feuilles. Aussi, le type de cultivar influence l'efficacité de la transformation. Le cultivar Arka Vikas est plus facile à transformer, comparativement au cultivar PED.
2 Effet de la durée de l'infection sur l'efficacité de la transformation de la tomate par Agrobacterium tumefaciens: Le temps d'infection pour 20 min a enregistré une efficacité de transformation maximale dans explants de cotylédons, en revanche, une durée d'infection dépassant 20 minutes diminue l'efficacité de la transformation.
3. Facteurs importants dans l'infection des plantes par Agrobacterium tumefaciens: la virulence d'Agrobacterium tumefacienscompte parmi les facteurs très importants dans l'infection bactérienne. Aussi, la présence de substances stimulantes de l'attachement d'Agrobacterium tumefaciens à la plante, est à considérer. Il s'agit surtout de phénols naturels. Le type de plantes est à prendre en considération dans l'infection. En effet, les dicotylédons sont plus aptes par rapport aux monocotylédons, quant à la transformation par Agrobacterium tumefaciens.
4. Proposez d'autres méthodes de transfert du transgène. D'autres méthodes de transfert peuvent être proposées si le transfert via Agrobacterium échoue. On peut citer le transfert physique par biolistique, transfert chimique par liposome, transfert chimique par le polyéthyléneglycol (PEG) et transfert sur protoplastes par électroporation. Lien: -- Méthodes de transfert des transgènes