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TP MARQUEURS ISOENZYMATIQUES CHEZ LE PALMIER DATTIER (Phoenix dactylifera L.)


Après leur séparation par électrophorèse, les isoenzymes du palmier dattier sont utilisées pour l'étude de la diversité génétique des palmeraies au Maroc.
بالإمكان قرائة أصل واحة نخيل مراكش بالمغرب من خلال جزيئات أوراقه ؟؟؟


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Isoenzymes, isozymes إيزوزيمات، أشباه أنزيمية Isoenzymes, isozymes
Electrophorèse كهرتهجير Electrophoresis
Palmier dattier نخيل التمر Date palm
Palmeraie de Marrakech واحة مراكش Marrakech palm grove

TP1. Eléctrophorèse. Technique de séparation selon la charge électrique et la taille des molécules


L'électrophorèse des enzymes extraites de feuilles de palmier dattier, est réalisée dans des conditions non dénaturantes. Tout chaffage du système est éliminé par refroidissement continu assuré par un cryostat. La mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée par la relation :
Mobilité = k . (pH - pI)/masse molaire,
où pI est le point isoélectrique de la molécule et pH, le pH du tampon de séparation.
Le principe de l'electrophorèse et le détail de la technique peuvent être revus en vistant le lien correspondant.


Echantillonnage, Extraction des enzymes et préparation des gels de polyacrylamide, support de migration en électrophorèse.

Afin de pouvoir interpréter les résultats à l'échelle de la génétique des population, l'échantillonnage doit concerner un nombre élevé de palmiers. Le matériel doit être aussi varié que possible pour couvrir toute la diversité de l'espèce. L'extraction des isoenzymes se fait à l'aide d'un tampon 'TAMET' (pH 7,0) de composition:
Tris 0,5 M, Acide ascorbique 0,3 M, 2-mercaptoéthanol 2% (v/v), EDTA Na2 0,01 M et Triton X-100 0,8% (v/v) (voir détail dans le polycopié).



Electrophorèse

L'électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide de concentration 11% (avec un gel de concentration de 5%). Le support de migration est préparé avant l'électrophorèse en confectionnant un moule à l'aide de deux plaques de verres séparées l'une sur l'autre par des bandes plastiques d'épaisseur 1 mm.
Lorsque le gel sont prêts, les extraits enzymatiques préalablement préparés à partir des feuilles de palmier dattier, seront déposés sur le gel pour être séparés.



Révélation des isoenzymes et interprétation des zymogrammes

Une fois l'électrophorèse est terminée, les gels (ici 2) sont révélés pour les enzymes choisies. Dans le premier TP on révèle deux enzymes simples, les estérases (EST) et les peroxydases (POX), une enzyme par gel. Dans le deuxième TP on analyse deux autres enzymes, révélées in situ; l'endopeptidase (ENP) et la Glutamate Oxaloacétate Transaminase (GOT)..

Par vidéo. Déroulement de la séance du travail pratique (TP) sur le marquage de type isoenzymes chez le palmier dattier:



TP 2. Interprétation des zymogrammes


1/ Zymogrammes des endopeptidases (ENP) et inventaire des génotypes au niveau du locus Enp

endopeptidase

Interprétations ---> voir vidéo (Ar. Fr):


2/ Zymogrammes de la glutamate oxaloacétate transaminase (GOT) et inventaire des génotypes au niveau du locus Got-2

transaminase

Interprétations ---> voir vidéo (Ar. Fr):


1/ En considérant les deux exemples de zymogramme par enzyme, préciser le nombre de zones de migration des isoenzymes des ENP et de la GOT. Ceci permet d'avoir une idée sur le nombre de loci qui codent pour ces enzymes (voir cours). Caractériser les zones par la valeur moyenne de leurs Rf (mobilité relative).
2/ Pour chaque locus (ou zone de migration), déterminer le nombre maximum de bandes. Sachant que le nombre de bandes le plus élevé se trouve chez les hydrides (héterozygotes), préciser la nature de l'enzyme (structure quaternaire = nombre de sous-unités) codée par locus (voir le cours).
3/ Pour chaque zone (ou locus), préciser sur combien de niveaux de migration se répartissent les différentes bandes ?. Ceci permet d'avoir une idée sur le nombres d'allèles par locus, lorsque l'enzyme est monomérique.
4/ Lorsque vous aurez déterminé le nombre de loci et la nature de l'enzyme exprimée, donner l'inventaire de tous les génotypes présentés par les zymogrammes des ENP et de la GOT.
Dans un tableau comparatif pour les deux populations de plants de palmier dattier, reporter la fréquences des différents génotypes représentant les ENP et la GOT. Quelle est la population qui contient plus d'héterozygotes ?. Calculer l'héterozygotie pour chacune d'elles (nombre d'héterozygoes divisé par le nombre total des individus étudiés).

TP 2 (suite)


Comment interpréter le zymogramme des endopeptidases (ENP)? --- voir vidéo (Ar. Fr):


Comment interpréter le zymogramme de la glutamate oxaloacétate transaminase (GOT) et faire l'inventaire des génotypes au niveau du locus got-2 ? -- voir vidéo (Ar. Fr):


3/ Test de conformité génétique des vitro-plants de palmier dattier

Selon ce zymogramme de la GOT, que peut-on dir de la conformité génétique de ce lot de 20 vitro-plants de palmier dattier issus issu de la culture in vitro (organogenèse) ?.

4/ Prédiction des parents de progénitures chez le palmier dattier

Selon ce zymogramme de la GOT des feuilles de 20 jeunes plants de palmier dattiers issus d'un croisement dirigé, peut on prédir les génotypes des parents mêle et femelle qui ont été utilisés dans le croisement ?.


TP 3. Etude de la diversité génétique du palmier dattier au Maroc par les marqueurs isoenzymatiques. Interprétation par le programme Biosys-1


TP 3 (polycopié). Etude de la diversité génétique du palmier dattier par Biosys-1 (pdf)

Ce TP se déroule dans une salle d'informatique.

Populations de palmier dattier au Maroc.

Les palmeraies marocaines sont réparties en plusieurs populations localisées principalement au sud dans les régions de Draa et Tafilalet . La palmeraie de Marrakech (1), située plus au nord, ne contribue pas à la production de dattes. Son origine reste encore inconnue.


Marqueurs isoenzymatiques et étude de la diversité génétique chez le palmier dattier.

Les marqueurs biochimiques et moléculaires comme les isoenzymes permettent d'identifier les ressources génétiques, d'étudier la diversité génétique et d'accompagner l'amélioration génétique des plantes.
Les endopeptidases (ENP) et la glutamate oxaloacétate transaminase (GOT) sont des exemples d'enzymes utilisées dans l'étude de la diversité génétique du palmier dattier (Fig. 2).

endopeptidasesGlutamate oxaloacétate transaminase (GOT)

Fig. 2. Représentations des zymogrammes des endopeptidases (ENP) et de la glutamate oxaloacétate transaminase (GOT) extraites des folioles de palmier dattier.

Les marqueurs biochimiques et moléculaires comme les isoenzymes permettent d'identifier les ressources génétiques, d'étudier la diversité génétique et d'accompagner l'amélioration génétique des plantes.
Les endopeptidases (ENP) et la glutamate oxaloacétate transaminase (GOT) sont des exemples d'enzymes utilisées dans l'étude de la diversité génétique du palmier dattier
En se basant sur plusieurs systèmes enzymatiques, des études effectuées sur les palmeraies marocaines ont pu identifier les cultivars (variétés) de façon précoce. Une clé d'identification des principales variétés de palmier dattier cultivées au Maroc.
Considérant la palmeraie de Marrakech (Marrakech palm grove, واحة مراكش) comme résultante de plants issus de graines inconnus, l'objectif du travail pratique sera l'identification du lot de graines (cultivar, parent femelle) le plus proche génétiquement de la palmeraie de Marrakech.
From which seedlings Marrakech palm grove was derived? من أي بذرات انبثقت واحة مراكش بالمغرب؟
Pour répondre à cette grande question, plusieurs lots de plants issus de semis (identifiés par le cultivar, parent femelle) sont analysés pour leur polymorphisme isoenzymatique et comparés à la population de Marrakech..


Analyse de la diversité génétique du palmier dattier par Le programme Biosys-1


Lien web: Lien pdf

Le programme Biosys-1 (Swofford & Selander, 1981) est un programme écrit en Fortran pour les études de génétique des populations.

BIOSYS-1 is a FORTRAN IV program designed to aid biochemical population geneticists and systematists in the analysis of electrophoretically detectable alletic variation. It can be used to compute allele frequencies and genetic variability measures, to test for deviation of genotype frequencies from Hardy-Weinberg expectations, to calculate F-statistics, to perform heterogeneity chi-square analysis, to calculate a variety of similarity and distance coefficients, and to construct dendrograms using cluster analysis and Wagner procedures. Inputs to BIOSYS-1 are ASCII files consisting of two basic components:
1) A brief header section, including a job title and locus labels;
2) One or more calls to "STEP" routines that give BIOSYS-1 information regarding the form of the data and the analyses that the program is to perform.

Accès au DOS et à l'éditeur 'Edit' pour la préparation du fichier de données (fichiers des entrées) et le lancement des calculs


Dans cet exemple, le programme (application) biosys et le fichier des données et le fichier des résultats (sortie) sont mis dans un répertoire c:\BIOSYS1. Le fichier d'entrées est de type .txt. Pour accéder au DOS et à l'éditeur, il faut procéder comme suivant:
- Démarrer --> saisir 'cmd' dans la fenêtre 'Rechercher les programmes et fichiers' et valider ou faire un clic double sur l'icône MS DOS (action 1). Pour revenir à la racine C:\, il faut saisir cd.. pour fermer les répertoires ouverts. Ensuite, il faut accéder au répertoire BIOSYS1 en saisissant cd BIOSYS1 et valider. (action 2)
- Saisir 'edit' et valider: l'éditeur s'ouvre (une fenêtre bleue) (action 3).

Biosys. Dos, Edit


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TP 3 (suite)


- Commencer à rentrer les données.
Les génotypes de chaque individu pour différents marqueurs étudiés sont introduits dans un ordre bien précis (voir la figure). Les espaces sont très importants. Les populations sont séparées par le mot 'NEXT'.


biosys fenêtre

Le début du fichier doit indiquer le nombre de populations (NOTU), le nombre de loci (NLOC) et le nombre maximum d'allèles (NALL). La fin du fichier doit mentionner les commandes à faire exécuter par le programme comme les variables de la diversité (fréquences alléliques, ..) et le dendrogramme. - STEP VARIAB: calcul des frequences alléliques et de l'hétérozygotie
- FULLOUT,PCRIT=2: critère 0,95 pour la définition d'un locus polymorphe. Si PCRIT=1, le critère du polymorphisme = 0,99
- Sauver le fichier dans le répertoire où existe le programme biosys (exemple C:\biosys1).

Lancement des calculs


Une fois les calculs sont lancés, les résultats sont sauvés dans un fichier de type 'resultats.out', crée automatiquement par le programme Biosys. Il s'ouvre dans l'éditeur Edit, mais il faut d'abord lancer les calculs.
Pour lancer les calculs, il faut rentrer dans le répertoire où est logé le programme biosys C:\biosys1): Démarrer --> saisir cmd (puis valider) dans la fenêtre de recherche. Accéder au répertoire C:\biosys1 en saisissant à chaque fois 'cd..'. Saisir la commande Biosys fichierX fichierX.outIl faut respecter les espaces entre les mots 'Biosys, 'fichier d'entrée' et 'fichier de sortie'.
Lefichier de sortie (exemple 'resultats.out') peut être lu dans l'éditeur Edit ou ouvert avec le programme notepad (option clic droit et ouvrir avec) pour lui ajouter des commentaires.

Données sur la palmeraie de Marrakech

Les diagrammes ci-dessous représentent les zymogrammes des systèmes enzymatiques GOT et ENP pour 28 palmiers dattiers (individus) collectés dans la palmeraie de Marrakech. Les deux génotypes (Got-2 et Enp) déterminés pour chaque individu, sont à saisir dans le programme biosys-1 (fichier d'entrée).

Glutamate oxaloacétate transaminase (GOT)
Endopeptidases (ENP). Zymogramme

Questions

1. A l'aide du programme 'Edit' du DOS, créer les fichiers 'palmeraies-grX' et 'palmier-semis-grX' et saisir les données relatives aux loci Got-2 et Enp concernant la palmeraie de Marrakech. Y ajouter les données des autres palmeraies marocaines. A la fin de chaque fichier, ajouter les commandes des calculs des paramètres de la diversité génétique.
2. Lancer le programme Biosys-1 en saisissant biosys palmeraies-grX palmeraies-grX.out
3. Interpréter les résultats relatifs aux indices de la diversité génétique et au dendrogrammes
4. D'après les résultats obtenus, proposer des hypothèses concernant l'origine de la palmeraie de Marrakech.


-->Liens utiles:


- Polycopié TP 1 + 2 (pdf)
- Interrogation TP1
- Contrôle TP


- Faire un Quiz formatif (Contrôle noté) sur les Biotechnologies des Plantes et Marqueurs moléculaires

QCM Biotech


BIOTECHNOLOGIES. QCM, EXERCICES

Biotechnologies.QCMs, Examens ..

Isoenzyme electrophoresis separates molecules according to their size and electrical charge. It allows studies on many species genetic diversity (see a video, master level)


Biotech-ecolo. net. Supports

- Youtube chaine

CHAINE YOUTUBE Chaine Youtube (abonnement). Plusieurs vidéos multilingues (+ s/titres) aux sujets des Biotechnologies et Biochimie


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- Cours du Master Biotechnologies et Amélioration des Plantes, Marrakech
- Master course 'Plant resistance against pathogens'


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Palmier dattier. Electrophorèse des isoenzymes, Biosys