Isoenzymes. Détection d'hybrides, Cuphea

DETECTION D'HYBRIDES INTERSPECIFIQUES DU GENRE CUPHEA PAR ELECTROPHORESE DES ISOENZYMES

Contrôle de la matière 'Marqueurs moléculaires et Amélioration des plantes' du module 'Biotechnologies et amélioration des plantes', Master 'Gestion et valorisation des phytoressources', S3, Février 2017", Faculté Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Morocco. Durée : 60 minutes
.......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve à la fin de l'épreuve

QUESTIONS

Afin d'exploiter la biodiversité et la diversité génétique des plantes dans la production d'acides gras à chaîne moyenne, Ronis et al. (1990, HortScience 25 :1431-34) ont étudié les marqueurs biochimiques et moléculaires susceptibles de détecter les hybrides résultants de croisements entre plusieurs espèces du genre Cuphea.

Cuphea viscosissima

Ainsi, 6 systèmes enzymatiques dont ceux de la phosphoglucomutase (PGM), la 6-phosphogluconate déshydrogénase (6-PGD) et la phosphoglucose isomérase (PGI), ont été utilisés dans l'éléctrophorèse sur gel d'amidon d'extraits foliaires provenant d'hybrides et leurs parents correspondant aux espèces Cuphea viscosissima (N = 6), Cuphea lutea (N = 14), Cuphea leptopoda (N = 10), Cuphea laminuligera (N = 10).
Les zymogrammes relevant du croisement N° 1069, C. viscosissima x C. lutea, sont résumés dans la figure 1.

Les plantes hybrides du croisement 1069 sont stériles. Les zymogrammes hypothétiques de la 6-PGD découlant de la discussion des résultats de cette étude relatifs au croisement N° 1006, C. leptopoda x C. laminuligera, sont montrés dans la figure 2.

Les plantes hybrides du croisement 1006 sont stériles. Leur fertilité peut être restaurée par doublement chromosomique à la colchicine.
1. Rappeler Le principe et la mise en évidence par électrophorèses des isoenzymes de la PGM et de la PGI.
2. En se référant à la figure 1, donner brièvement une interprétation possible (nombre de loci, structure de l'enzyme et nombre d'allèles) des zymogrammes de PGM, 6-PGD et PGI.
3. Evaluer l'efficacité du marquage isoenzymatique par PGM, 6-PGD et PGI dans l'identification des hybrides interspécifiques résultant du croisement N° 1069 (fig. 1) et du croisement N° 1006 (Fig. 2). Justifier les réponses.
4. Rappeler d'autres investigations biotechnologiques possibles susceptibles de répondre au but tracé par cette étude. Justifier les réponses.

REPONSES BREVES

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Réponse à la Question 1: Principe et la mise en évidence par électrophorèses des isoenzymes de la PGM et de la PGI:
- L'électrophorèse des isoenzymes se fait dans des conditions non dénaturantes (minimiser le chauffage par circulation de l'eau froide à l'aide d'un cryostat).
- Révélation in situ par apport des substrats des enzymes directement sur le gel, une fois l'éléctrophorèse est terminée.
Les transférases, comme la phosphoglucomutase (PGM) et les isomérases, comme la glucose phosphate isomérase (PGI), peuvent être visualisées indirectement, car, elles peuvent fournir un produit qui peut être déshydrogéné par une autre enzyme (enzyme indicatrice) utilisant un des coenzymes NAD+ ou NADP+. La glucose 6-phosphate déshydrogénase (GPDH) (enzyme de la réaction indicatrice). L'enzyme de la réaction indicatrice, ne pouvant pas diffuser rapidement dans le gel, le mélange réactionnel est étalé en une couche mince d'agarose sur le gel de séparation.
Lien utile: Révélation PGM et PGI.

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REPONSES BREVES (suite)

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Réponse à la Question 2: interprétation possible (nombre de loci, structure de l'enzyme et nombre d'allèles) des zymogrammes de PGM, 6-PGD et PGI.
En se limitant aux zymogrammes de la figure 2, on peut proposer les interprétations suivantes:
- PGM: Deux loci, dont un locus au niveau zone 'upper' codanr pour une enzyme monomérique avec 2 allèles.
- 6-PGD: 2 loci: locus pour la zone 'upper' (enzyme dimérique avec deux allèles), un locus zone 'lower ' (structure monomérique avec 2 allèles).
- PGI: 3 loci zones 'upper', 'middle' et 'lower', structures indéterminées.
Réponse à la Question 3: Evaluation de l'efficacité du marquage isoenzymatique par PGM, 6-PGD et PGI dans l'identification des hybrides interspécifiques résultant du croisement N° 1069 (fig. 1) et du croisement N° 1006 (Fig. 2):
- Concernant le croisement interspécifique N° 1069, C. viscosissima x C. lutea, les 3 systèmes enzymatiques (PGM, 6-PGD et PGI) se sont montrés de bons marqueurs dans la détection des hybrides. En effet toutes les isoenzymes montrés par les parents mâle et femelle, se sont retrouvées chez l'hybride interspécifique. Néanmoins, les plantes F1 restent stériles pour pouvoir les multiplier par graines (ceci est dû aux nombres de chromosomes différents chez les parents).
- Concernant le croisement interspécifique N° 1006, C. leptopoda x C. laminuligera, Les zymogramme de la 6-PGD des hybrides sont similaires aux zymogrammes des parents femelles ('zymogrammes maternels'. La 6-PGD ne peut pas être utilisée comme marqueur des hybrides pour ce croisement. Plusieurs causes peuvent être à l'origine de ce résultat dont un echec au niveau de la fécondation malgré que le nombre des chromosomes des parents est le même (Cuphea leptopoda (N = 10), Cuphea laminuligera (N = 10)).
Réponse à la Question 4: Le transfert des gènes lors d'un croisement interspécifique, est confronté aux problème d'interstérilité des déscendants. La transformation génétique par transgénèse peut être proposée comme alternative. Le gène d'intérêt peut être, ici, le gène codant pour une enzyme de synthèse d'acides gras à chaîne moyenne.